00_DIARIO LABORATORIO_Laboratorio

No cronológico Dudas

19-04-2021: PREPARAR MEDIOS 3L MS- y 2L MS+. Autoclavarlos

PLANTAS:
Preparamos

● MS sin sacarosa (3L-2L placas normales para plantas-1L placas grandes con
kanamicina para plantas)
-2,2g/L Murashige & Skog Basal Medium with Vitamins (MS+vitamins)
-8g/L plantagar
pH 5,75 ajuste con KOH

● MS con sacarosa (2L para hongo Alternaria alternata)
-2,2g/L Murashige & Skog Basal Medium with Vitamins (MS+vitamins)
-8g/L plantagar
-30g/L sacarosa
pH 5,75 ajuste KOH

Vaso de precipitados, añadir pulga y tarar. Pesamos MS y añadimos 900-800ml H2O
ultrapura, se agita. Se añade KOH 1M hasta que el pHchimetro mide 5,75. Se vierte la
solución en una probeta y se enrasa hasta 1L. Se vuelca en la botella junto al plantagar, se
cierra, se agita y etiqueta. (MS - JP 19-04-2021) Se mete al autoclave, al sacarlo se mete en
la estufa a 50ºC.

*El plantagar es un agente gelificante que se gelifica después de autoclavarse ya que solo
se disuelve en calor.

20-04-2021: PREPARAR MEDIO LB AGAR. PLAQUEAR MS: 3L MS - (2L PLACA NORMAL
Y 1L PLACAS GRANDES Kn) + 2L MS+

PLANTAS:
Preparamos

● Medios LB para las bacterias (2L)
- 1L Kanamicina PTGXgal (100 mg/ml, uso: 50µl/ml (disolución 1:2000)
- 1L Spectinomicina PTGXgal (100 mg/ml, uso: 100µl/ml (disolución 1:1000)

-20g/L de LB
-15g/L Bacto Agar

Plaqueamos el LB (ayer, ya autoclavado).
-3L MS sin sacarosa: 2L placas normales y 1L placas grandescon Kn (1L MS: 500µl Kn)
-2L MS con sacarosa : placas normales

*Los antibióticos (Kn) se degrada a más de 50ºC
*(1L: 40 placas normales (2 racks))

26-04-2021: REACCIÓN Y 3h30’ TERMOCICLADOR. LANZAR SEMILLAS WT PARA WT
CON/SIN COMPUESTOS VOLÁTILES

BIOBRICKS:
R1: p35sUVR8TNOS → pDBG1α1
Concentración: 75ng/µl

-3µl agua
-1µl P35s
-1µl PUPD2 UVR8
-1µl TNOS
-1µl PDGB1α1
-1µl BSA 1 (enzima)
-1µl T4 ligase (enzima)
-1µl ligase buffer
V⊤= 10µl

Primero realizamos una dilución 1:3 del PUPD2 UVR8 que tenemos a 224 ng/µl, para
conseguirlo a 75 ng/µl pero para evitar el margen de error la realizaremos a 2:6. (4µl H2O
2µl stock).

Después de realizar el procedimiento metemos el eppendorf en el termociclador,
programado con el golden braid para realizar 25 veces 1ciclo-2min-37ºC y 2ciclo-5min-26ºC.
(3h30’). Posteriormente se guardará en el frigorífico a 4ºC.

PLANTAS:
Hoy también lanzamos las semillas WT. Primero las esterilizamos, 1ml de etanol 70% 1 min,
a continuación se lavan en 1ml lejía ¼ 10 min. Después en la cabina de flujo laminar,
anteriormente activada, se procede a hacer lavados con agua esteril para retirar cualquier
tipo de resto de las sustancias anteriormente utilizadas para esterilizarlas. Con una pipeta
(azul) comenzamos a lanzar las semillas en 6 placas sin kanamicina, sobre un folio en
blanco para facilitar la visión de las semillas. Se reservan estas placas en la cámara de
cultivo (1semana).

No plaqueamos medios día anterior, ya había suficientes placas

27-04-21: R1 ELECTROPORACIÓN 1H EN MOVIMIENTO Y PLAQUEAR. LANZAR
SEMILLAS WT, PAP1 L2 Y PAP1 L7

BIOBRICKS:
Electroporación de la R1

Se introduce 1µl de R1 en un eppendorf de TOP10 con la pipeta gris. Preparamos el
termociclador a 37º y LB para la recuperación de las bacterias en un falcon, además de un
eppendorf nuevo y la pipeta amarilla. Se introducen en la cubeta las TOP10, conservadas
en frío todo el rato y se prepara el electroporador en E.coli a 25 de capacitancia y 1,25V. Se
electroporan las bacterias y rápidamente se introducen en 1 ml de LB, se agitan y se
introducen en un eppendorf que dejaremos en termomixer 1h a 37ºC

Después de 1h se procede a sembrar las bacterias en placas de LB PTGXgal con Kn.
Realizaremos este procedimiento en semiesterilidad con un mechero bunsen. Realizaremos

tres placas (10µl, 15µl, 20µl), en estas se depositan las bacterias y a continuación se
introducen bolitas de siembra para repartir las bacterias y se retiran después de agitar. Las
dejamos O.N. a 37º en la estufa.

PLANTAS:
Lanzamos las semillas PAP1 l.2 y l.7 en placas de MS-(sin sacarosa) con Kn (3 y 3),
realizando el mismo procedimiento que el día anterior con las WT. En la cabina de flujo
laminar.

28-04-21: SACAR R1 Y DEJARLAS EN FRIGORÍFICO. LANZAR SEMILLAS F0.

BIOBRICKS:
Revisamos las colonias fallidas de la R1 y volvemos a realizar el mismo procedimiento con
30µl, 50µl, 60µl y las volvemos a dejar O.N. en la estufa.

PLANTAS:
F0: (semillas modificadas)
En primer lugar se esterilizan las semillas dejándolas 2 minutos en etanol 70% y 20min en
lejía 1:4 , en movimiento. A continuación se realizan lavados de agua en la cabina de flujo
laminar previamente encendida . Esta vez las lanzamos en 3 placas grandes de Ms - con
Kn. El 25% de las semillas morirán y sólo las semillas con el gen introducido crecerán.

Retiramos el H2O sobrante de los lavados. Utilizamos agarosa 0 '1% para evitar que las
semillas se retengan en el fondo de los tubos blancos. Calentamos la agarosa autoclavada
con el tapón un poco abierto e introducimos 3 o 4 ml por tubo, lo movemos y lo volcamos en
la placa esparciendo las semillas. Se sellan y se llevan a la cámara de cultivo.

03-05-21: R1: REACCCIÓN Y 3h30’ TERMOCICLADOR (REPETICIÓN). PASAR A
TIERRA WT PARA WT +/- VCs. SACAR FOTOGRAFÍAS A LAS PLACAS F0.

BIOBRICKS:
Repetimos la R1 ya que no salió correctamente posiblemente por error de pipeteo.

PLANTAS:
Trasplantamos WT:
-6 macetas cuadradas con 2 plantas por cada una, para transformar.
-Bandeja de 51 hueveras con 2 plantas en cada cesto, para someter a radiación. 20 se
pondrán en contacto con compuestos volátiles y otras 20 sin.

Para transpantalas hay que utilizar tierra (3 pindstrup y 1 vermiculita) que servirá para airear
el sustrato. La congelan para matar los huevos de mosca del mantillo. (-120º 2-3 semanas).
Primero regamos la tierra para que esté húmeda, etiquetamos y cogemos plantas de
tamaño similar para irlas colocando en la tierra con pinzas. Dejaremos estas plantas en el
fitotrón 2 con una tapa de plástico para retener la humedad 1 semana para que retengan la
humedad y se adapten mejor, después de una semana se retira el plástico y se van regando
desde la bandeja de abajo.

*Mismo tamaño:

-WT: 1 semana (reservar 2 para transplantar mañana, comparación con PAP1)
-PAP1: 6 días (1 placa con hongos L.7)

04-05-21: R1: ELECTROPORACIÓN, 1h EN MOVIMIENTO Y PLAQUEAR (REPETICIÓN).
PASAR A TIERRA WT, PAP1 L2 Y PAP1 L7

BIOBRICKS:
Electroporación de R1 (como en el día 27)
Sembrar R1 esta vez 15µl, 20µl,40µl por placa
Estufa 37ºC ON

PLANTAS:
Trasplantar PAP1 de 5 placas de l.2 y l.7 (7 días)
-17 macetas de la línea 2
-17 macetas de la línea 7
Colocaremos 3 plantas en cada maceta por si acaso, de tamaño parecido.

Trasplantar WT de 2 placas (8 días)
-17 macetas

10-05-21: R2: REACCIÓN Y 3h30’ TERMOCICLADOR. AIREAR SUSTRATO Y DEJAR 1
PLANTA POR MACETA WT +/- VCS. SUBCULTIVAR Alternaria alternata.

BIOBRICKS:
Lanzamos 3 colonias blancas que hemos obtenido. Como no nos da tiempo vamos a utilizar
unas de stock de glicerol que sabemos que tienen la R1 bien introducida [241,18] µl/ml
(ng/µl).

R2: para introducir plásmido PAP1 (colonia 4) (2019)
Concentración: 75ng/µl

-PDGB1α1 UVR8 75ng/µl 1µl→ dilución 241,18 µl/ml → 2:6 (1:3) 4 agua 2 stock
-PDGB1α2 PAP1 75ng/µl 1µl→ dilución 306 ng/µl → 2:8 (1:4) 6 agua 2 stock
-pdgb1Ω2 1µl
-Bsm B1 1µl
-T4-ligasa 1µl
-Buffer 1µl
-H2O 4µl

En primer lugar siempre el agua y por último los enzimas.

PLANTAS:
Preparamos el hongo Alternaria alternata en la cabina de flujo laminar.
Necesitamos placas de Alternaria, 8 placas de LB con sacarosa, pinzas, etanol y una
bombona. Se limpian las pinzas con etanol y se pasan por una mecha para esterilizarlas. Se
coge un poquito de hongo y se pone en una de las placas con sacarosa.En cada placa
colocaremos 5 pellizcos en forma de pentagono y 1 en medio. Se dejan en la estufa de
30ºC 1 semana.

Cogemos las plantas WT del fitotrón después de 1 semana para airear la tierra y dejar una
sola planta por huevera.

11-05-21: R2: ELECTROPORACIÓN 1h EN MOVIMIENTO Y PLAQUEAR. AIREAR
SUSTRATO Y DEJAR 1 PLANTA POR MACETA, WT, PAP1 L2 Y PAP1 L7.

BIOBRICKS:
Electroporación R2.
-cubeta: 1ml LB,TOP10+ 1µl R2
1h termomixer a 37ºC

Sembrar bacterias en placas LB con Spectinomicina PTGXgal (5µl,15µl,20µl,30µl,40µl,50µl)
Estufa 37ºC ON

*Electroporación: choque térmico para introducir los plásmidos a la bacteria, aumentando la
conducta eléctrica. Por ello, trabajamos con bacterias TOP10, ya que poseen poros en la
membrana para poder introducir el plásmido mediante este proceso.
*E.coli: solo crece ADN circular

PLANTAS:
Dejar 1 planta por maceta huevera WT, PAP1 L2 Y PAP1 L7 (con el mismo tamaño)

17-05-21: LANZAR CULTIVOS ON. PONER EN CONTACTO WT + AA

BIOBRICKS:
Lanzar cultivos R2:
-1 falcon/colonia
-10 ml LB líquido estéril
-10 µl Espectinomicina (antibiótico) esteril en congelador 1:1000

Primero enumerar falcons, introducir 10 ml de LB y añadir 10 µl Spectinomicina (agitar).
Previamente se ha descongelado en el Vortex el antibiótico. A continuación, con la punta de
una pipeta picar colonias blancas seleccionadas e introducir en el falcon. Y al agitador a 180
rpm 37ºC O.N.

PLANTAS:
20 placas con A.a (7 placas de Alternaria alternata)
20 placas sin A.a
Cubrir ambas bandejas con film transparente. Las dejaremos 1 semana y a continuación
otras semana de aclimatación. Pasadas estas 2 semanas, las someteremos a RadUV.

*Los compuestos volátiles de A.a interactuarán con el metabolismo y la planta producirá
más pigmentos que le hará ser más grande.

18-05-21: R2: MINIPREPS + CONCENTRACIONES.

BIOBRICKS:

MINIPREPS: extraer plásmido de las bacterias, para comprobar que es el correcto.
1º El cultivo de LB trás la agitación, contiene millones de bacterias, y por lo tanto es turbio.
2º Centrifugar a máximas revoluciones (3600rpm) 10 min, para que las bacterias se
depositen en la parte de abajo de los falcons (Pellet)
3º Quitar sobrenadante (LB) dando la vuelta. (El Pellet no se desprende)
4º Añadir 250µl Solución I (RNaseA) (4ºC): dar un vortex para resuspender
5º Añadir 250µl Solución II, agitar gentilmente
6º Añadir 350µl Solución III, agitar y centrifugar 13.000rpm 10min
Poner eppendorf azul con membrana en eppendorf blanco y numerar.
7º Aspirar sobrenadante, depositar a eppendorf azul con membrana y desechar Pellet.
Centrifugar 1min. Desechar lo que queda en el eppendorf blanco abajo.
8º Añadir 500µl HBC Buffer (con Isopropanol). Centrifugar 1min.
9º Añadir 700µl DNA Walsh Buffer (con Etanol). Centrifugar 1 min. Repetir este paso 2
veces.
10º Centrifugación en vacío (2min). Quitar etanol.
11º Coger eppendorf azul y poner en eppendorf 1,5ml.
12º Añadir 100µl agua en la membrana para arrastrar DNA que se encuentra en la
membrana. Centrifugar 1min. Obtener plásmido en el eppendorf. Quitar eppendorf azul.
13º Guardar a -20ºC

CONCENTRACIONES con el espectofotometro. Medir absorbancias.
Para ello: dilución 1:50 (2µl plásmido y 98µl agua)
Blanco: eppendorf 100µl agua. Para poner a 0 el espectofotometro (Read blanc)
Programa que utilizamos: DNA doble cadena. Dilución 1:50

Resultados concentraciones:
1. 391,57 µl/mL
2. 399, 44 µl/mL
3. 432, 16 µl/mL
4. 239, 45 µl/mL
5. 469, 39 µl/mL
6. 272, 56 µl/mL
7. 281, 61 µl/mL
8. 444, 43 µl/mL

19-05-21: DIGESTIÓN+correr gel agarosa. Resultados R2. Experimento RadUV WT, PAP1
L2 y PAP1 L7. Cortar plantas.

PLANTAS:
Introducimos 51 plantas PAP1 para irradiar en el biotrón durante 2h30’ con lámparas de luz
UV.
Cortar plantas para poder transformar en 1 semana, y que los óvulos estén en el correcto
estadio. Cortando por encima del brote para tener más ramificaciones.

BIOBRICKS:
DIGESTIÓN: Enzimas fast digestivo (1h): digerir plásmido (cortar trozos). No queremos
tamaños muy parecidos.

Utilizamos enzima NCOI:
1 banda de 4550 pares de bases
1 banda de 1566 pb
1 banda de 903 pb
2 bandas de 390 pb (vemos solo 1)

Plásmido (Concentración: 1000 ng/µl. 3-5 µl de plásmido dependiendo de las
concentraciones)
2µl Buffer (Green buffer). Tiene glicerol (pesa)
1µl Enzima NCOI
Agua
V⊤: 20µl

Para evitar errores de pipeteo, realizamos 2 mix agrupando colonias con concentraciones
parecidas:
-MIX 3µl (colonias 1,2,3,5,8)
3µl de cada plásmido
10µl Buffer
5µl enzima
70µl Agua

-MIX 4µl (colonias 4,6,7)
4µl de cada plásmido
6µl Buffer
3µl enzima
39µl Agua

GEL AGAROSA: Separar fragmentos de ADN mediante voltaje)
Preparar gel agarosa en cubeta.
-Agarosa (1%: 4g agarosa y 400mL Tae 1x)
-30µl Midori Green (alicuotar)
Tenemos 8 muestras + 3 (5µl) marcadores: 15 pocillos. Poner peine de 15 pocillos.
Esperar 15-20 minutos en gelificar.
Quitar peine y cubrir cubeta con Buffer Tae 1x
Depositar muestras en los pocillos con pipeta (20µl)
Electroforesis (polos negro y rojo: atraen los fragmentos de ADN)

21-05-21: 1º Cosecha 2 DAT RadUV WT, PAP1 L2 y PAP1 L7

Cosechar la mitad PAP1 y WT, las otras dejar crecer (control visual)
Cortar roseta y pesar (peso fresco/fresh weight FW)
Meter rosetas en 3 falcons (uno por cada línea) con Nitrógeno líquido (congelar rápido para
que no se degraden los compuestos vegetales, y medir más adelante antocianos y
carotenoides)

SEGUIMIENTO PAP1 y WT:

-Sembrado: 1 día
-A tierra: 7 días
-Dejar 1 planta por maceta: 14 días
-Tratamiento RadUV: 21 días
-Cosecha: 2DAT (days after treatment): 23 días
-Fotografías: 3 DAT, 4DAT, 5 DAT, 6 DAT: 27 días

*2DAT: más diferencias de antocianos y carotenoides, por ello hacemos la cosecha a los 2
días. Aunque visualmente no se vean daños hasta los 4-5 días

PESAJES (2DAT): Báscula de precisión
-WT: 7 fotos, 7 pesajes
-PAP1 L2: 8 fotos y 9 pesaje
-PAP1 L7: 8 fotos y 9 pesaje

WT (mg) PAP1 L2 (mg) PAP1 L7 (mg)
75,5 75,4 57,9
121,8 95,9 118,1
68 80,2 100,2
91,7 103,7 126
45,8 110,1 104,7
65,8 79,5 94,6
60,4 75,9 79,7
94,1 100,7
75,9 26,4

Falcons con muestras a ultracongeladores

*DAT (Days After Treatment)

24-05-21: R3 reacción y 3h30’ termociclador. Comenzar aclimatación WT+A.a. Lanzar
cultivos Agro.

BIOBRICKS:
R3: UVR8 PAP1 (colonia 8) Kn → pDGB3α1 (el vector más grande)
Concentración: 75ng/µl

-4µl agua
-1µl pDBG1Ω1 Kn Rv (reverse)
-1µl pDBG1Ω2 UVR8 PAP1 (colonia 8: 444,43ng → dilución 1:6 = 2:12)
-1µl PDGB1α1

-1µl Bsa I (enzima)
-1µl T4 ligase (enzima)
-1µl ligase buffer
V⊤= 10µl

Lanzar bacterias (Agro + construcción (en glicerol)) en 100mL LB líquido (estéril), en matraz
autoclavado. Raspar en el eppendorf de Agro con punta pipeta (sin coger cantidad) y
depositar en el LB que hemos vertido en el matraz. Añadimos los antibióticos de selección:
50µl Kn/100mL y 100µl Rifampicina/100mL

*Para guardar construcción final, electroporar colonias (con gen insertado correctamente) en
Agrobacterium tumefaciens (Agro EHA105).

Tapamos el matraz con papel albal y al agitador 2 días a 28ºC

PLANTAS:
Comenzar aclimatación WT+A.a

25-05-21: R3 Electroporación, 1h en movimiento y plaquear.

BIOBRICKS:
Electroporación R3.
-cubeta: 1ml LB,TOP10+ 1µl R3
1h en termomixer a 37ºC

Sembrar bacterias en placas LB con Kn PTGXgal (10µl,20µl,30µl)
Estufa 37ºC ON

26-05-21: Sacar placas R3 y dejarlas en el frigorífico. Infiltración Agro en AT.

BIOBRICKS/PLANTAS:
Agro Infiltración. Densidad ópticas.
1º Centrifugación 25mins 4000 rpm. Dividir 100mL matraz de Agro en 2 falcons (50mL)

En un bote añadir:
-70mL Buffer
-14µl Silwet (detergente que daña las membranas del ovario) (10µl/50mL)
-0,7µl BAP (convierte más virulente al Agro) (0,5µl/50mL)
2º Quitar sobrenadante
3º Resuspender pellet (con 12mL buffer)
4º Medir densidad óptica falcon con bacterias. Medir a 600 nanómetros (cubetas especiales
para bacterias)
En una cubeta 900µl medio de infiltración y 100µl falcon de bacterias. Medir absorbancia
(densidad óptica: 1,381). Y otra cubeta, para utilizar de blanco (1mL medio de infiltración).
La densidad óptica necesaria: 2.
Utilizando la fórmula: Volumen inicial x Concentración inicial = V.final x C.final

Vi x 1,4x10 (porque hemos diluido 1:10) = 50 x 2
Vi (bacterias) = 7,14mL Medio infiltración: 42,86mL. Vf: 50mL

5º Transformar: 1 bandeja de papel y plantas previamente regadas (humedas).
Introducir planta entera (hasta la roseta) en el vaso de precipitados con la dilución (7
plantas)
Tapar bandeja con film y dejar 2 días.

1-06-21: R3: Minipreps+concentraciones. Experimento RadUV WT +/- VCs

BIOBRICKS:
Minipreps R3 y Concentraciones R3.
Concentraciones:

1. 353,7 µg/mL
2. 186,6 µg/mL
3. 471,3 µg/mL
4. 416,5 µg/mL
5. 465,9 µg/mL
6. 518,5 µg/mL

PLANTAS:
WT con Compuestos Volátiles: 4 control y 12 RadUV
WT sin Compuestos Volátiles: 4 control y 17 RadUV

SEGUIMIENTO PLANTAS WT:
-Sembrado: 1 día
-A tierra: 7 días
-Dejar 1 planta por maceta: 14 días
-20 plantas con A.a (con film): 21 días
20 plantas sin A.a (con film): 21 días
-Aclimatación: 28-35 días
-Tratamiento RadUV: 35 días
-Cosecha: 2DAT (days after treatment): 37 días
-Fotografías: 3 DAT, 4DAT, 5 DAT, 6 DAT: 41 días

2-06-21: R3:Digestión+correr gel agarosa. Resultados R3. Preparación protocolo.
Carotenoides y Antocianos WT, PAP1 L2, PAP1 L7.

BIOBRICKS:
Digestión R3: pDGB3α1 PAP1 UVR8 Kn
Concentraciones: 6 colonias
Digestión enzimas: ECORI (1µl) y PST I (1µl) → 6345, 3176, 2639, 654. 1h 37ºC
Gel Agarosa: M 1 2 3 M 4 5 6 (Voltaje 120)

PLANTAS:
PROTOCOLO ANTOCIANOS:
Materiales:
-Lecheras con nitrógeno líquido (-170ºC: congela muestras, sin romper las moléculas)
-Mortero
-Vaso de precipitados pequeño
-Muestras

-Eppendorfs de rosca (para evitar perder solvente)

*Según las características de las moléculas, distinto solvente para extraer al máximo las
moléculas.
*Trabajar rápido para evitar que se degraden los pigmentos

1ºMoler el material (congelado previamente tras la cosecha). *Enfriar el mortero antes.
Material molido → eppendorf 2mL

2º 3 repeticiones de cada muestra WT, PAP1 L2 y PAP1 L7
Carotenoides: <100mg
Antocianos: 200mg

PESOS:

WT (carotenoides) WT (antocianos)
1. 66,6 mg 1. 169, 8 mg
2. 53,7 mg 2. X
3. x 3. X

PAP1 L2 (carotenoides) PAP1 L2 (antocianos)
4. 62,5 mg 4. 207,7 mg
5. 83,5 mg 5. 140,5 mg
6. x 6. x

PAP1 L7 (carotenoides) PAP1 L7 (antocianos)
7. 67,9 mg 7. 206,4mg
8. 64,2 mg 8. 98,1 mg
9. x 9. x

Detener la actividad de la muestra
1mL acetona 80% → carotenoides
1mL buffer MFV ´→ antocianos

Dar un vórtex → frigo 4ºC ON (todos los eppendorf con muestras)

3-06-21: 1º Cosecha 2DAT RadUV WT +/- VCs. Mediciones Carotenoides y Antocianos
WT,PAP1 L2, PAP1 L7.

PLANTAS:
CONTINUACIÓN PROTOCOLO ANTOCIANOS
ON → vórtex
3º Centrifugación 10mins

Numerar eppendorfs 1,5mL
14578
1 4 5 7 8 pH1 1,2mL X2
1 4 5 7 8 pH4,5 1,2mL X2
4º Separar sobrenadante del pellet (volcando)
5º Guardar sobrenadante en eppendorfs 1 4 5 7 8
6º Resuspendar pellet con 500µl de buffer de extracción MFV
7º Vortexear para resuspender 1min
8º Centrifugar 10min

9º/10º Separar sobrenadante del pellet a los mismos eppendorfs 1 4 5 7 8
11º Tirar pellet
12º Por duplicado

pH1 (1,2mL) x2: 1 4 5 7 8 +300µl sobrenadante de los eppendorfs
pH4,5 (1,2mL) x2: 1 4 5 7 8 +300µl sobrenadante de los eppendorfs

13º Agitación Termomixer sin temperatura. Frio 4ºC (2horas)
Preparar blancos para medir absorbancias:
-1,2mL pH1 + 300µl MFV
-1,2mL pH4,5 + 300µl MFV

14º Medir absorbancias

pH 1.0 pH 4.5

FW A700 A512 A700 A512

1 0,031 0,112 0,004 0,072

0,049 0,113 0,057 0,131

4 0,003 0,088 0,031 0,096

0,009 0,086 0,018 0,083

5 0,02 0,097 0,059 0,089

0,043 0,117 0,004 0,064

7 0,066 0,156 0,033 0,066

0,052 0,151 0,000 0,071

8 0,011 0,065 0,022 0,013

0,031 0,089 0,006 0,051

CONTINUACIÓN PROTOCOLOS CAROTENOIDES
3º Centrifugar 10min.
Diluir muestras
500µl acetona 80%
500µl sobrenadante
4º Medir absorbancias (espectrofotometro λ). Distintas longitudes de onda:
710nm (para medir turbidez)
663nm y 646nm (máximas absorbancias clorofilas (2picos) y un poco de carotenoides)
470nm (picos absorbancias carotenoides)
5º Muestras → cubetas
*Blanco 1mL acetona 80%

FW A710 A663 A646 A470
1 -0,027 1,605 0,702 1,564
1,,708 0,747 1,649
-0,011 1,391 0,665 1,324
2 0,106 1,273 0,554 1,198
1,613 0,711 1,541
-0,015 1,597 0,717 1,499
4 -0,017 1,974 0,918 1,871
1,925 0,868
0,002 1,589 0,715 1,608
5 0,037 1,890 0,851 2,337
1,648 0,742 1,609
-0,009 1,573 0,710 1,588
7 0,008

-0,006
8 -0,015

-0,02

08-06-21: Digestión R3 y Gel Agarosa R3

BIOBRICKS:
Repetir digestión R3 y Gel Agarosa.