เอกสารองค์ความรู้

จากภาพท่ี 4 พบวา่ annealing temperature ท่ีเหมาะสมสำหรับเครื่องหมายโมเลกุล Ex2-78 ไดแ้ ก่
58 องศาเซลเซียส โดยผลการทำปฏิกิริยาพีซีอาร์ปรากฏแถบดีเอ็นเอ 3 แถบดังน้ี แถบดีเอ็นเอขนาด 416 bp
เกิดจาก Forward outer primer(FO) และ Reverse outer primer(RO) แถบดีเอ็นเอขนาด 253 bp ท่ี
แสดงสนิปอัลลีล A เกิดจาก Forward inner primer(FI) และ Reverse outer primer(RO) และแถบดีเอ็นเอ
ขนาด 220 bp ที่แสดง สนิปอัลลีล G เกิดจาก Forward outer primer (FO) และ Reverse inner primer (RI)
ซ่ึงพันธ์ุต้านทาน TME3 มี สนิปอัลลีล G แบบโฮโมไซกัส (GG) ณ ตำแหน่ง Ex2-78 สอดคล้องกับผลทดสอบ
เครื่องหมายโมเลกุลชนิดสนิปโดยใช้เทคนิค Pyrosequencing (ตารางท่ี 3) พันธ์ุระยอง 5 แสดงจีโนไทป์แบบ
เฮเทอโรไซกสั คือ มที ั้งอัลลีล A และ G (AG) ขณะที่พันธ์ุระยอง 3 แสดงจีโนไทป์แบบโฮโมไซกสั ของอัลลลี A (AA)
สำหรับ annealing temperature อื่นๆ ได้แก่ 66, 64 หรือ 60 องศาเซลเซียสไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ
ได้ตรงตามขนาดท่คี าดหมายในแต่ละอัลลีลได้ครบ

สภาวะที่เหมาะสมสำหรับเคร่ืองหมายโมเลกุล Ex2-157 ได้แก่ annealing temperature ท่ี 60
องศาเซลเซียสและมี Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% เป็นส่วนประกอบในการทำปฏิกิริยาพีซีอาร์โดยพันธ์ุ
ต้านทาน TME3 ปรากฏสนิปอัลลีล T แบบโฮโมไซกัส (TT) (ภาพที่ 4) สำหรับเคร่ืองหมายโมเลกุล Ex3-128
น้ัน annealing temperature ท่ีเหมาะสมคือ 60 องศาเซลเซียสโดยไมต่ ้องมี DMSO เป็นส่วนประกอบในการ
ทำปฏกิ ริ ยิ าพีซีอาร์พนั ธุ์ตา้ นทาน TME3 ปรากฏสนิปอลั ลลี T แบบโฮโมไซกัส (TT) (ภาพท่ี 4)

การนำผลงานวิจัยไปใช้ประโยชน์

งานวิจัยนี้สามารถช่วยคัดเลือกพันธุ์มันสำปะหลังหรือลูกผสมท่ีต้านทานโรคใบด่าง CMD โดยการใช้
เครื่องหมายโมเลกุล เพื่อจะได้นำพันธ์ุหรือลูกผสม candidate ดังกล่าวไปตรวจสอบกับเช้ือโรคจริงและเม่ือ
พบว่าเป็นพันธ์ุหรือต้นต้านทานโรคใบด่าง CMD สามารถนำไปใช้เป็นพันธุ์พ่อและพันธุ์แม่ในกระบวนการ
ปรับปรุงพันธ์ุหรือพัฒนาพันธุ์ต่อไป ซึ่งช่วยลดระยะเวลา พื้นที่ และแรงงานในการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์
มนั สำปะหลังได้

เอกสารอา้ งองิ

จีราพร แก่นทรัพย์ ธนาวดี ค้ำชู วิภาวี ชั้นโรจน์ สุภาวดี ง้อเหรียญ สุวลักษณ์ อะมะวัลย์ และ ประพิศ วอง
เทียม. 2564. วิธีสกัดดีเอ็นเอจากมันสำปะหลังที่รวดเร็ว ประหยัด และปราศจากตัวทำละลาย
อนิ ทรียอ์ นั ตราย. ว.วิชาการเกษตร. 39(2): 189-201.

จีราพร แก่นทรัพย์ ประเสริฐ วงศ์วัฒนารัตน์ และ ขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์. 2563ก. เคร่ืองหมายดีเอ็นเอ
สำหรับคดั เลือกพันธพ์ุ ืชต้านทานโรค. ว.วิชาการเกษตร. 38(2): 207-222.

เทคโนโลยีชวี ภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพนั ธม์ุ นั สำปะหลงั 50

จีราพร แก่นทรัพย์ สุวลักษณ์ อะมะวัลย์ ประพิศ วองเทียม อรุโณทัย ซาววา สุภาวดี ง้อเหรียญ

ดนัย นาคประเสริฐ และ จิณณจาร์ หาญเศรษฐสุข. 2563ข. การใช้เคร่ืองหมายโมเลกุลในการคัดเลือก

พันธ์ุมนั สำปะหลังตา้ นทานโรคใบดา่ ง Cassava Mosaic Disease. ว.วชิ าการเกษตร. 38(1): 68-79.

ภูวนารถ มณีโชติ สุนัดดา เชาวลิต กาญจนา วาระวิชะนี วาสนา รงุ่ สวา่ ง ภานุวัฒน์ มลู จันทะ ศริ ิลักษณล์ า้ นแก้ว

และประภาพร แพงดา. 2561. การสำรวจและเฝ้าระวังโรคใบด่างมันสำปะหลังท่ีเกิดจากเชื้อไวรัส.

รายงานผลงานวจิ ยั เรือ่ งเต็ม ปี 2561. สำนกั วจิ ัยพัฒนาการอารักขาพชื กรมวชิ าการเกษตร. 47 หนา้ .

มณฑล เลิศวรปรีชา. 2554. ประยกุ ต์ในงานวจิ ยั ทางจุลชีววิทยา. ว.มหาวิทยาลยั ทักษณิ . 14 (1): 111–118.

ศูนย์สารสนเทศการเกษตรสำนักงานเศรษฐกิจการเกษตร. 2562. สถิติการค้าสินค้าเกษตรไทยกับต่างประเทศ

ปี 2561. กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ISSN 0858 2327. 143 หนา้ .

สำนักงานเศรษฐกิจการเกษตร. 2562. สถติ กิ ารเกษตรของประเทศไทย ปี 2561. กระทรวงเกษตรและสหกรณ์

กรงุ เทพมหานคร. ISSN 0857 6610. 186 หน้า.

Akano, A.O., A.G.O. Dixon, C. Mba, E. Barrera and M. Fregene. 2002. Genetic mapping of a dominant

gene conferring resistance to cassava mosaic disease. Theor. Appl. Genetics. 105: 521-525.

Carmo, C.D., M.S. Silva, G.A.F. Oliveira and E.J. Oliveira. 2015. Molecular-assisted selection for

resistance to cassava mosaic disease in Manihot esculentaCrantz. Sci. Agric. 72(6): 520-527.
Devi, K.D., K. Punyarani, N.S. Singh, et al. 2013. An efficient protocol for total DNA extraction

from the members of order Zingiberales- suitable for diverse PCR based
downstream applications. Springer Plus. 2: 669.
Edwards, K., C. Johnstone and C. Thompson. 1991. A simple and rapid method for the
preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19:1349.
Fregene, M., N. Morante, T. Sánchez, J. Marin, C. Ospina, E. Barrera, J. Gutierrez, J. Guerrero, A.
Bellotti, L. Santos, A. Alzate, S. Moreno and H. Ceballos. 2006. Molecular markers for
introgression of useful traits from wild Manihot relatives of cassava, marker-assisted
selection (MAS) of disease and root quality traits. J. Root. Crops. 32: 1-31.
Kotchoni, S.O. and E.W. Gachomo. 2009. A rapid and hazardous reagent free protocol for
genomic DNA extraction suitable for genetic studies in plants. Mol. Biol. Rep. 36:
1633–1636.
Legg, J.P. and J.M. Thresh. 2000. Cassava mosaic virus disease in East Africa: a dynamic
disease in a changing environment. Virus Research. 71: 135-149.
Lokko,Y., E.Y. Danquah, S.K. Offei, A.G.O. Dixon and M.A. Gedil. 2005. Molecular markers
associated with a new source of resistance to the cassava mosaic disease. Afr. J.
Biotechnol. 4 (9): 873-881.

เทคโนโลยชี ีวภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพันธมุ์ นั สำปะหลงั 51

Okogbenin, E., M.C.M. Porto, C. Egesi, C. Mba, E. Ospinosa, L.G. Santos, C. Ospina, J. Marin, E.
Barera, J. Gutierrez, I. Ekanayake, C. Iglesias and M. Fregene. 2007. Marker aided
introgression of CMD resistance in Latin American germplasm for genetic
improvement of cassava in Africa. Crop. Sci. 47: 1895-1904.

Ribeiro, P.F., R. Akromah and J. Manu-Aduening. 2012. Using marker assisted selection to hasten
screening of cassava cultivars developed through introgression of Cassava Mosaic
Disease (CMD) resistance into cassava landraces in Ghana. J. Agr. Sci. Tech. B 2: 74-80.

Romeis, T. 2001. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant. Biol. 4:
407–414.

Van Ooijen, G., G. Mayr, M.M.A. Kasiem, M. Albrecht, B.J.C. Cornelissen and F.L.W. Takken.
2008. Structure–function analysis of the NB-ARC domain of plant disease resistance
proteins. J. Exp. Bot. 59(6): 1383–1397.

Wolfe, M. D., I. Y. Rabbi, C. Egesi, M. Hamblin, R. Kawuki, P. Kulakow, R. Lozano, D. P. D. Carpio,
P. Ramu, and J. Jannink. 2016. Genome-Wide Association and Prediction Reveals
Genetic Architecture of Cassava Mosaic Disease Resistance and Prospects for Rapid
Genetic Improvement. Plant Genome 9. doi:10.3835/plantgenome2015.11.0118

เทคโนโลยีชวี ภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลอื กพนั ธมุ์ นั สำปะหลัง 52

การคดั เลอื กพนั ธ์มุ ันสำปะลงั ต้านทานโรครากปมโดยการใช้เคร่ืองหมายโมเลกลุ

มัลลกิ า แก้ววิเศษ

ความสำคัญของโรครากปมในมันสำปะหลัง
โรครากปมของมนั สำปะหลังท่ีเกดิ จากไสเ้ ดือนฝอย Meloidogyne spp. จากการศึกษาทางชีวโมเลกุล

พบว่าเป็นไส้เดือนฝอยรากปมในเขตร้อนชื้น (Meloidogyne incognita, M. javanica และ M. arenaria)
(สญชัยและบัญชา, 2557) พบในประเทศต่างๆ ท่ีปลูกมันสำปะหลัง เช่น บราซิล เวเนซุเอลา สหรัฐอเมริกา
โมซัมบิก ยูกันดา มาลาวี ไนจีเรีย และไนเจอร์ (Coyne, 1994) ในประเทศไทยมีรายงานโรคน้ีเม่ือปี พ.ศ. 2521
(สืบศักดิ์ และคณะ, 2521) จากการสำรวจและประเมินความเสียหายในปี พ.ศ. 2554 ท่ี อ.บำเหน็จณรงค์
จ.ชัยภูมิ พบว่าไส้เดอื นฝอยเข้าทำลายมนั สำปะหลงั พันธห์ุ ้วยบง 80 ทำใหผ้ ลผลิตลดลงถึง 70% (อดุ มศักด์ิและ
บัญชา, 2555) โดยตัวอ่อนระยะเข้าทำลายแพร่กระจายในดินปลูก สามารถเข้าทำลายรากมันสำปะหลังได้
ตั้งแต่รากเร่ิมงอกหลังปักท่อนพันธุ์ ไส้เดือนฝอยเคล่ือนตัวตามความชื้นในดินเข้าเจาะไชบริเวณปลายรากและ
เคลอ่ื นทสี่ ู่ท่อน้ำทอ่ อาหารของราก จากน้ันเริ่มดูดกินน้ำเล้ียงของพชื และเจรญิ เตบิ โตเป็นตัวเตม็ วัยท้ังเพศผูแ้ ละ
เพศเมีย ตัวเมียสามารถสร้างไข่เป็นกลุ่มๆ ละ 200 - 300 ฟองต่อตัวเมีย 1 ตัว และฟักเป็นตัวอ่อนลงดินและ
กลับเข้าทำลายรากได้อย่างต่อเนื่อง ในเวลาเพียง 20 - 25 วัน มันสำปะหลังจะไม่ลงหัวหรือลงหัวไม่สมบูรณ์
เม่ือถูกไส้เดือนฝอยเข้าทำลาย มันสำปะหลังที่เป็นโรครากปมนี้จะไม่แสดงอาหารผิดปกติใดๆ บนส่วนเหนือดิน
ทจี่ ะทำใหท้ ราบวา่ มันสำปะหลังถูกไสเ้ ดือนฝอยทำลาย แต่ในกรณที ่ีถกู ไสเ้ ดือนฝอยทำลายอย่างรนุ แรงจะแสดง
อาการเหี่ยวคล้ายอาหารขาดน้ำ (อุดมศักดิ์, 2555) ดังน้ันเกษตรกรจงึ ไม่ทราบวา่ ผลผลติ หัวมันสำปะหลังมีปริมาณ
และคุณภาพเปน็ อย่างไร หลังจากที่ต้องใช้เวลาในการปลูกจนถงึ เก็บเกีย่ วนาน 10 - 12 เดือน นุชนารถ (2558)
ได้ศึกษาพันธุ์มันสำปะหลังที่พันธ์ุต้านทานต่อรากปมคือ ระยอง7, ระยอง 13, ระยอง 60, ระยอง 72 และ
เกษตรศาสตร์ 50 ส่วนพันธท์ุ ี่อ่อนแอต่อโรครากปมคือ ระยอง 2, ระยอง 5, ระยอง 9, ระยอง 11, ระยอง 90,
หว้ ยบง 60, ห้วยบง 80 และพริ ุณ

ในประเทศไทยได้มีการศึกษาโรครากปมในมันสำปะหลัง โดยอุดมศักดิ์และบัญชา (2555) ได้รายงาน
ความเสียหายของมันสำปะหลังจากโรครากปมจากไส้เดือนฝอย ที่ อ. บำเหน็จณรงค์ จ.ชัยภูมิ เม่ือปี 2554
พบว่า พันธ์ุห้วยบงมีความเสียหายถึง 80% สญชัย และบัญชา (2557) ได้ศึกษาไส้เดือนฝอยสาเหตุโรครากปม
ในมันสำปะหลัง พบว่า เป็นไส้เดือนฝอยในเขตร้อนช้ือ (Meloidogyne incognita, M. javanica, และ
M. arenaria) นุชนารถ และคณะ (2558) ได้คัดเลือกและประเมินเช้ือพันธุกรรมมันสำปะหลังต้านทานไส้เดือนฝอย
พบว่าพันธ์ุท่ีเกษตรกรนิยมปลูกและแสดงความต้านทานโรครากปมคือ ระยอง7, ระยอง 13, ระยอง 60,
ระยอง 72 และเกษตรศาสตร์ 50 ส่วนพันธุ์ท่ีอ่อนแอต่อโรครากปมคือ ระยอง 2, ระยอง 5, ระยอง 9, ระยอง 11,
ระยอง 90, ห้วยบง 60, ห้วยบง 80 และพริ ุณ 1
การคัดเลอื กลกั ษณะตา้ นทานโรครากปมในมนั สำปะหลงั โดยใช้เครือ่ งหมายโมเลกุล

เทคโนโลยีชีวภาพเพ่ือการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธมุ์ นั สำปะหลัง 53

ในการปรับปรุงพันธ์โุ ดยใช้เครอ่ื งหมายโมเลกุลเข้ามาร่วมด้วยจะทำใหก้ ารปรับปรุงพันธเ์ุ ป็นไปได้อย่าง
รวดเร็ว เนื่องจากสามารถคัดเลือกลูกผสมกลับที่คาดว่ามีจีโนไทป์ที่ต้องการได้อย่างรวดเร็ว ไม่ต้องรอให้แสดง
ลักษณะที่สนใจ เช่น ลักษณะต้านทานโรคก็ไม่จำเปน็ ตอ้ งทดสอบความต้านทานโรคนั้น สามารถคดั เลือกตั้งแต่
ต้นเลก็ ๆ ได้เลย (สุรินทร์, 2552)

ในต่างประเทศไม่มีการการศึกษาเครื่องหมายโมเลกุลของโรครากปมในมันสำปะหลังโดยตรง แต่มี
การศึกษาเครอ่ื งหมายโมเลกลุ ในพชื ชนิดอื่นๆ Jablonska et al. (2007) ไดศ้ ึกษายีนทต่ี ้านทานไสเ้ ดอื นฝอยใน
มะเขือเทศ พบว่าคือ ยีน Mi Bakooie et al. (2015) ได้พัฒนาเคร่อื งหมายโมเลกุลแบบ SNP ในการคดั เลือก
พันธุ์หัวบีท ให้ต้านทานไส้เดือนฝอย Draaistra (2006) ได้ศึกษายีนที่ต้านทานโรครากปมจากไส้เดือนฝอยใน
มันฝรงั่ พบว่า ยีนท่ตี า้ นทาน M. chitwoodi คอื Rmc1

การทำโมเลกุลเคร่ืองหมายมีหลายวิธีด้วยกัน เทคนิคหนึ่งที่เป็นท่ีรู้จักคือ (Amplified Fragment
Length Polymorphism) ซ่ึงเป็นเทคนิคที่อยู่ระหว่าง RFLP และ RAPD ทำให้สามารถศึกษาช้ินของดีเอ็นเอ
ได้คราวละ 50 - 200 ชิ้น สามารถแยกความแตกต่างได้ 2 แบบ คือ 1) point mutation ในบริเวณ
restriction site หรือใน selective nucleotide of primers 2) small insertion/deletion ภายในช่วงของ
restriction fragment ผลคือได้แถบดีเอ็นเอขนาดต่างกัน (หทัยรัตน์, 2544) เทคนิค AFLP เป็นเทคนิคท่ี
เหมาะสมสำหรับการสำรวจจีโนมพืชหรือสัตว์ท่ีไม่เคยมีการศึกษามาก่อน เป็นวิธีการท่ีรวดเร็วในการค้นหายีน
หรือ DNA marker ที่อยู่ติดกับลักษณะสำคัญทางเศรษฐกิจ ช่วยให้การสร้าง satured linkage map ประสบ
ผลในระยะเวลาส้ัน ซ่ึงเป็นการเพิ่มโอกาสของการได้ marker ท่ี link กับลักษณะสำคัญและยังสามารถ
วิเคราะห์ความจำเพาะของสงิ่ มชี ีวิต (วิภา, 2544)

ในการปรับปรุงพันธโุ์ ดยใช้เครอ่ื งหมายโมเลกลุ เขา้ มารว่ มด้วยจะทำให้การปรับปรุงพันธ์ุเป็นไปได้อย่าง
รวดเร็ว เน่ืองจากสามารถคัดเลือกลูกผสมกลับที่คาดว่ามีจีโนไทป์ที่ต้องการได้อย่างรวดเร็ว ไม่ต้องรอให้แสดง
ลักษณะท่ีสนใจ เช่น ลกั ษณะต้านทานโรคก็ไม่จำเปน็ ตอ้ งทดสอบความต้านทานโรคนนั้ สามารถคัดเลือกตั้งแต่
ต้นเลก็ ๆ ได้เลย (สุรินทร์, 2552) ซง่ึ ในปัจจุบันเครือ่ งหมาย SNP เปน็ เครือ่ งหมายทีไ่ ดร้ ับความนยิ มมากที่สุดใน
ขน้ั ตอนพัฒนาเคร่อื งหมายโมเลกุลในการคัดเลือก นอกจากนี้เครื่องหมาย SNP ยังสามารถวเิ คราะห์ตัวอย่างได้
เปน็ จำนวนมาก มีค่าใช้จา่ ยต่อหน่วยข้อมูลท่ีได้คอ่ นขา้ งต่ำเมือเทยี บกับเคร่ืองหมายชนิดอ่นื จึงเหมาะกับการใช้
เครอ่ื งหมายในการคัดเลือกจรงิ ในการปรับปรงุ พนั ธ์ุพชื (กิตติพัฒน์, 2564)

ข้ันตอนการศึกษาการใช้เครือ่ งหมายโมเลกุลมาเพื่อคดั เลือกลักษณะตา้ นทานโรครากปม
ในการศึกษาการใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาเพ่ื อคัดเลือกลักษณะต้านทา นโรครากป มมันสำปะหลัง

มขี ้นั ตอนตา่ งๆ ดังน้ี
1. เก็บตัวอย่างมนั สำปะหลงั

เทคโนโลยีชวี ภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธมุ์ นั สำปะหลงั 54

การเก็บตัวอย่างจะใช้ใบมันสำปะหลัง 2 - 3 ใบต่อต้น โดยเก็บตัวอย่างจากพันธุ์มันสำปะหลังท่ีมี
ข้อมลู ในการทดสอบความต้านทานโรครากปมจากไสเ้ ดือนฝอยอย่แู ลว้ เพอ่ื มาทำการสกัดดเี อ็นเอ

2. การสกัดดีเอ็นเอ
การสกัดดีเอ็นเอมันสำปะหลังสามารถทำได้โดยใช้ชุดคทิ หรือดว้ ยวิธี CTAB ซงึ่ วิธี CTAB มขี ัน้ ตอน

การทำดังนี้
1.1 ตดั ใบมนั สำปะหลงั 2 กรัม ใสล่ งในโกรง่ เตมิ ไนโตรเจนเหลวแล้วบดใหแ้ ห้งเป็นผงแป้ง
1.2 นำใบมันสำปะหลังท่ีบดแล้ว ใส่ในหลอด 1.5 มิลลิลิตร แล้วเติม extraction buffer (บ่ม

อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร เขย่าให้ส่วนผสมเข้ากัน แล้วนำไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 60 องศา
เซลเซยี ส เป็นเวลา 1 ช่วั โมง เขยา่ ทกุ ๆ 20 นาที

1.3 เติม chloroform-isoamyl alcohol (24:1) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร (1 เท่าของข้อ 2) ผสมให้
เข้ากัน โดยการเอียงหลอดไปมาเบาๆ หรือใชเ้ ครือ่ ง shaker เบาๆ นาน 10 นาที

1.4 นำไปป่ันเหวี่ยงด้วยเคร่ือง centrifuge ที่ความเรว็ 12000 รอบ/นาที นาน 10 นาที ดูดน้ำใส
สว่ นบนปริมาตร 750 ไมโครลิตร ใส่หลอดขนาด 1.5 มลิ ลิลติ ร

1.5 เติม chloroform-isoamyl alcohol (24:1) ปริมาตร 750 ไมโครลิตร ผสมใหเ้ ข้ากันโดยการ
เอียงหลอดไปมาเบาๆ นาน 10 นาที

1.6 นำไปปั่นเหว่ยี งด้วยเคร่ือง centrifuge ที่ความเรว็ 12,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที ดูดน้ำใส
ส่วนบนปรมิ าตร 750 ไมโครลิตร ใสห่ ลอดขนาด 1.5 มลิ ลิลติ ร

1.7 ตกตะกอนด้วย isopropanol 0.6 เท่า ของสารละลายดเี อน็ เอ
1.8 เติม isopropanol 0.6 เท่า ของสารละลายดีเอ็นเอ และ3M NaOAC 0.1 เท่า ของ
สารละลายดีเอ็นเอ ผสมโดยการเอียงหลอดคว่ำลงช้าๆ (inverted) นำไปแช่ในตู้เย็น -20 องศาเซลเซียส นาน
30 นาที ระยะนีจ้ ะเหน็ ตะกอนดเี อน็ เอเปน็ เส้นใยสีขาวใส
1.9 นำไปป่ันเหวี่ยงด้วยเครื่อง centrifuge ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ความเร็ว 12,000 รอบ/
นาที นาน 10 นาที เพ่อื ตกตะกอนดอี น็ เอ เทนำ้ ใสทง้ิ
1.10 ล้างตะกอนดีเอ็นเอด้วย 70% ethanol ปริมาตร 750 ไมโครลิตร (2 ครั้ง) โดยเขย่าเบาๆ
2-3 นาที นำไป centrifuge ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ความเร็ว 12,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที นาน 5 นาที
เทน้ำใสทิ้ง
1.11 ละลายดีเอ็นเอที่แห้งแล้วด้วย TE buffer ปริมาตร 100 ไมโครลิตร และเติม RNaseA
(10 มิลลิลิกรัม/มิลลิลิตร) ปริมาตร 4 ไมโครลิตร นำไปไว้ที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที หรือ
อณุ หภมู ิ 37 องศาเซลเซยี ส นาน 30 นาที
1.12 เก็บ Original DNA ที่ไดไ้ วท้ อี่ ณุ หภมู ิ -20 องศาเซลเซยี ส
3. การวเิ คราะห์ GBS

เทคโนโลยชี วี ภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลอื กพันธม์ุ นั สำปะหลัง 55

เม่อื ได้ดเี อ็นเอจากใบมันสำปะหลังแล้ว สามารถส่งตัวอยา่ งไปวิเคราะห์ GBS ท่ีบริษทั ท่ีรับวิเคราะห์

ซึ่ง GBS มาจากคำว่า Genotyping-by-Sequencing คือเทคนิคท่ีใช้ในการค้นหาเครื่องหมายโมเลกุล SNP

(single nucleotide polymorphism, SNP) ซ่ึงเป็นกระบวนการค้นหา SNP แบบท่ัวทั้งจีโนม (genome-

wide SNP discovery) ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ร่วมกับการใช้เทคโนโลยี Next

Generation Sequencing (NGS) ในการหาลำดับเบส เทคนิค GBS สามารถค้นหาและจีโนไทป์ SNP ได้ใน

ขั้นตอนเดียว ซึ่งสามารถค้นหา SNP ได้มากถึง 50,000 - 100,000 ตำแหน่งจากจีโนม จึงสามารถนำมา

ประยุกต์ใช้กับสิ่งมีชีวิตได้ทุกสปีชีย์ รวมถึงส่ิงมีชีวิตท่ียังไม่มีข้อมูลทางจีโนมิกส์ การค้นหาเคร่ืองหมายโมเลกุล

ในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคโนโลยี GBS จึงช่วยประหยัดเวลาและค่าใช้จ่ายได้อย่างมากเม่ือเทียบกับการหา

ลับดับเบสทั้งจีโนม (Whole genome sequencing) นอกจากนี้เทคนิค GBS ยังมีประโยชน์อย่างยิ่งในการ

พัฒนา SNP สำหรับใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุล (DNA marker) เพ่ือใช้เป็นเคร่ืองหมายโมเลกุลมาใช้ในการ

คัดเลือกสายพันธุ์ (Marker-Assisted Selection หรือ MAS) การปรับปรุงพันธุ์ อีกท้ังยังสามารถใช้โมเลกุล

เครื่องหมายเพ่ือตรวจเอกลักษณ์ของสายพันธุ์ ตรวจสอบสายพันธุ์ลูกผสม การจัดจำแนกพันธ์ุส่ิงมีชีวิตที่มีฐาน

พันธุกรรมใกล้เคียงกัน นอกจากน้ียังสามารถนำข้อมูล GBS มาร่วมวิเคราะห์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง

ลำดับเบสตอ่ ลักษณะปรากฎ (Genome-wide association study หรือ GWAS) ได้

4. การออกแบบ tetra primer

โดยใช้ข้อมูลท่ีได้จาก GBS และข้อมูลมันสำปะหลังสายพันธ์ุที่ส่งตัวอย่างไป หาความสัมพันธ์กับ

ลักษณะความต้านทานและความอ่อนแอต่อโรครากปมของมันสำปะหลัง เม่ือได้ตำแหน่งของ SNP ทำการ

ออกแบบไพร์เมอร์ 2 คู่ คือคู่นอกและคู่ในเพ่ือตรวจสอบด้วยวิธี tetra-primer ARMS-PCR โดยให้ขนาดของ

แถบดเี อ็นเอทจ่ี ะไดจ้ ากการทำไพรเ์ มอร์ทั้งสองคู่มคี วามแตกต่างกนั เพื่อที่จะเหน็ ขนาดไดช้ ดั เจน

5. การตรวจสอบ SNP

ทำการตรวจสอบ SNP จากตัวอย่างดีเอ็นเอของมันสำปะหลังท่ีมีข้อมูลแล้วว่าต้านทานโรครากปม

โดยใช้วิธี tetra-primer ARMS-PCR ซ่ึงใช้ไพร์เมอร์ 2 คู่ คือ คู่นอกและคู่ใน จากน้ันเตรียมตัวอย่างเพื่อทำ

ปฏกิ รยิ า PCR กบั ดเี อ็นเอแตล่ ะตวั อยา่ งของมันสำปะหลงั ดังน้ี

GoTaq Green 12.5 µl

primer-1F 10pmol 0.5 µl

primer-2R 10pmol 0.5 µl

primer-3F 10pmol 0.5 µl

primer-4R 10pmol 0.5 µl

DNA Template 100ng 2 µl

H2O 3.5 µl
Total 20 µl

เทคโนโลยีชีวภาพเพ่ือการจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพนั ธมุ์ นั สำปะหลัง 56

จากนั้นนำเข้าเคร่ือง PCR โดย ข้ันตอนการทำปฏิกิริยาพีซีอาร์ประกอบไปด้วย 1) บ่มท่ีอุณหภูมิ
95 องศาเซลเซียส 2 นาที จำนวน 1 รอบ 2) บ่มที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส 30 วินาที จากนั้นบ่มที่
อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส 90 วินาที และอุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส 30 วินาที ในขั้นตอนที่ 2 ทำ 35 รอบ
3) บม่ ที่อุณหภมู ิ 72 องศาเซลเซียส 5 นาที

6. การทดสอบเคร่อื งหมายโมเลกุล
เมื่อได้ผลการทดสอบแล้ว เลือกเคร่ืองหมายโมเลกุลท่ีสามารถตรวจสอบลักษณะต้านทานของโรค

รากปมในมันสำปะหลังได้ นำเคร่ืองหมายโมเลกุล ไปทดสอบในประชากรมันสำปะหลงั ลูกผสมที่มีพันธุ์พ่อหรือ
พันธุ์แม่เป็นพันธุ์ต้านทานโรครากปม และทดสอบเคร่ืองหมายโมเลกุลในประชากรทุกต้น เพื่อทำการคัดเลือก
ตน้ ทมี่ ีลักษณะตา้ นทานโรครากปมไว้ใชใ้ นการปรบั ปรุงพนั ธุ์ต่อไป

การนำไปใชป้ ระโยชน์

การใช้เครื่องหมายโมเลกุลไปใช้คัดเลือกพันธ์ุมันสำปะหลังต้านทานโรครากปม โดยการตรวจสอบ SNP
โดยใช้ไพร์เมอร์ที่ออกแบบใหม่พบว่าสามารถนำไปตรวจสอบคัดเลือกพันธ์ุมันสำปะหลังท่ีต้านทานต่อโรครากปมได้
ในปัจจุบันเคร่ืองหมาย SNP เป็นเครื่องหมายที่ได้รับความนิยมมากท่ีสุดในขั้นตอนพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล
ในการคัดเลือก นอกจากนี้เครื่องหมาย SNP ยังสามารถวิเคราะห์ตัวอย่างได้เป็นจำนวนมาก มีค่าใช้จ่ายต่อ
หน่วยข้อมูลท่ีได้ค่อนข้างต่ำเมือเทียบกับเครื่องหมายชนิดอ่ืน จึงเหมาะกับการใช้เคร่ืองหมายในการคัดเลือก
จริงในการปรับปรุงพันธ์ุพืช ดังนั้นการใช้เคร่ืองหมายโมเลกุล SNP มาใช้ในการคัดเลือกพันธ์ุมันสำปะหลัง จะ
ช่วยประหยัดเวลาในการปรับปรุงพันธ์ุกว่าวธิ ีด้ังเดิม เพราะสามารถคัดเลือกลูกผสมมันสำปะหลังที่เราต้องการ
ให้มีลักษณะต้านทานโรครากปม เพ่ือจะนำปรับปรุงพันธุ์เพ่ือไปใช้ในการปลูกมันสำปะหลังในแหล่งท่ีมีปัญหา
โรครากปมของมันสำปะหลงั

เอกสารอ้างองิ

กิติพัฒน์ อุโฆษกิจ. 2564. เคร่ืองหมายโมเลกุลเพื่อการปรับปรุงพันธุ์พืช. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์.
391 หน้า.

ทหัยรัตน์ อุไรรงค์. 2544. ลายพิมพ์ดีเอ็นเอกับการศึกษาความหลากหลายทางชีวภาพ. เอกสารประกอบการ
สมั มนาเชิงปฏิบตั ิการการตรวจสอบลายพมิ พด์ เี อน็ เอดว้ ยเทคนิค AFLP. 45 หนา้ .

นชุ นารถ ตงั้ จิตสมคิด, ภานุวัฒน์ มูลจันทะ, อดุ มศักด์ิ เลิศสุชาตวนิช และ โอภาษ บุญเส็ง. 2558. การคัดเลือก
และประเมินเช้ือพันธุกรรมมันสำปะหลังต้านทานไส้เดือนฝอยรากปม. รายงานผลงานวิจัย
ฉบับสมบรู ณ์. สำนกั งานพฒั นาวิทยาศาสตรแ์ ละเทคโนโลยแี ห่งชาติ, จ.ปทุมธาน.ี 69 หน้า.

เทคโนโลยชี ีวภาพเพ่อื การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพันธม์ุ นั สำปะหลงั 57

วิภา หงส์ตระกูล. 2544. ผลงานวิจัยการประยุกต์ใช้ลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิค AFLP. เอกสาร
ประกอบการสัมมนาเชงิ ปฏบิ ตั ิการการตรวจสอบลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วยเทคนิค AFLP. 45 หนา้ .

สญชัย ขวัญเกื้อ และบัญชา ชิณศรี. 2557. การใช้วิธีทางชีวโมเลกุลในการจำแนกชนิดไส้เดือนฝอยรากปมที่
ทำลายมันสำปะหลังในอำเภอด่านขุนทด จังหวัดนครราชสีมา หน้า 278-283 ใน เรื่องเต็มการ
ประชมุ ทางวชิ าการของมหาวิทยาลยั เกษตรศาสตร์ คร้ังท่ี 52 สาขาพชื

สุรินทร์ ปิยะโชคณากุล. 2552. เครื่องหมายโมเลกุลจากพ้ืนฐานสู่การประยุกต์. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัย
เกษตรศาสตร์ กรงุ เทพ. 269 หนา้

สืบศักดิ์ สนธิรัตน, เกษกานดา สิทธิสุข, วฒั นะ นรสิงห์, สุทนิ ราชธา และชัลวาล สวุ รรณสาร. 2521. ไส้เดือนฝอย
ศัตรูพืชในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ. ใน: เอกสารงานวิจัยฉบับที่ 3. สำนักงานเกษตรภาคตะวันออก
เฉยี งเหนอื ทา่ พระ, ขอนแกน่ .

อุดมศักดิ์ เลิศสุชาตวนิชและบัญชา ชิณศรี. 2555. การสำรวจและประเมินความเสียหายจากโรครากปมของ
มันสำปะหลัง หน้า 391-395 ใน เรื่องเต็มการประชุมทางวิชาการของมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
ครั้งท่ี 50 สาขาพชื

Bakooie, M., E. Pourjam, S.B. Mahmoudi, N. Safaie and M. Naderpour. 2015. Development of
and SNP Marker for Sugar Beet Resistance/Suscptible Genotyping to Root-Knot Nematode.
J. Agr. Sci. Tech. Vol 17:443-454.

Coyne, D.L. 1994. Nematode Pests of Cassava. African Crop Science Journal 2(4): 355-359.
Draaistra, J. 2006. Genetic analysis of root-knot nematode resistance in potato. Thesis Wageningen

Universissty, The Netherland.
Jablonska, B., J.S.S. Ammiraju, K.K. Bhattarai, S. Mantelin, O. M. Ilarduya, P.A.Robert and I.
Kaloshian. 2007. The Mi-9 Gene from Solanum Arcanum Conferring Heat-Stable Resistance to

Root-Knot Nematodes Is a Homolog of Mi-1. Plant Physiology, vol 143 p 1011-1054.

เทคโนโลยีชวี ภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพนั ธม์ุ นั สำปะหลงั 58

การคัดเลอื กพนั ธม์ุ นั สำปะลังท่เี ก่ียวข้องกบั ปรมิ าณไซยาไนด์โดยการใช้เคร่ืองหมายโมเลกุล

อจั ฉราพรรณ ใจเจรญิ

มนั สำปะหลัง (Cassava) มีถิ่นกำเนิดอยู่ในทวีปอเมรกิ าใต้ บราซิลหรือเมกซิโก เปน็ พชื ใบเลี้ยงคู่ อยู่ใน
ตระกูล Euphorbiaceae มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Manihot esculenta Crantz จัดเป็นพืชอาหารท่ีสำคัญอันดับ
5 ของโลก รองจากข้าวสาลี ข้าวโพด ข้าว และมันฝรั่ง เป็นพืชท่ีสำคัญทางเศรษฐกิจลำดับต้นๆ ของไทย
มนั สาํ ปะหลังเป็นพืชที่ปรับตัวไดด้ ีในเขตแล้ง หรือแม้แต่ในท่ีมีความอดุ มสมบูรณ์ต่ำและเป็นพืชทีใ่ หผ้ ลผลติ แป้งสูง
เป็นแหล่งพลังงานท่ีดี มันสำปะหลังเป็นพืชที่เก็บสะสมอาหารไว้ในราก เมื่อพืชมีการสร้างอาหารจากใบและ
สว่ นที่เป็นสีเขียวแล้ว จะสะสมในรูปของคาร์โบไฮเดรต คือ แป้งไว้ในราก ความสามารถในการสร้างและสะสม
แป้งในรากมีความแตกต่างกัน นอกจากนี้อายุเก็บเกี่ยว ปริมาณน้ำฝนในช่วงแรกก่อนการเก็บเก่ียวและปัจจัยอื่นๆ
มีผลต่อส่วนประกอบของหัวมันด้วยองค์ประกอบส่วนใหญ่ในรากน้ัน มีแป้งถึงร้อยละ 70 - 80 จึงถือว่า
มันสำปะหลังเปน็ พืชทีเ่ ป็นแหลง่ ของคารโ์ บไฮเดรตที่ให้พลังงานกับคนและสตั ว์ได้ดีที่สุด

มันสำปะหลังท่ีปลูกในประเทศไทยส่วนใหญ่เป็นชนิดขม มีปริมาณกรดไฮโดรไซยานิกสูงและเป็นพิษ
ไม่เหมาะสำหรับการบริโภคของมนุษย์หรือใช้หัวสดเล้ียงสัตว์โดยตรง แต่จะใช้สำหรับในอุตสาหกรรมแปรรูป
ต่างๆ ดังนั้นมันสำปะหลังท่ีเป็นท่ีต้องการคือ ให้ผลผลติ สูงทั้งในด้านน้ำหนักหัวและปริมาณแป้ง อย่างไรก็ตาม
ในมันสำปะหลังมีสารไซยาโนเจนิคกลูโคไซด์ท่ีสะสมในรูปกรดไฮโดรไซยานิก ซ่ึงจะสะสมอยู่ในรากของ
มันสำปะหลัง เมื่อรับประทานเข้าไปแล้วจะสามารถถูกเปลี่ยนเป็นไซยาไนด์ท่ีเป็นสารพิษร้ายแรงได้ สารพิษ
ชนิดน้ีจะทำให้เกิดอาการผิดปกติทางระบบประสาท โดยมีอาการชา ความรู้สึกผิดปกติตาพร่ามัว สูญเสียการ
มองเห็น เสียการทรงตัว หหู นวก และอาการอัมพาต ดังน้ันจงึ ต้องมีกระบวนการกำจดั สารไซยาโนเจนิคกลูโคไซด์
ออกจากมันสำปะหลงั และผลิตภัณฑ์จากมันสำปะหลังก่อนการส่งออกเพ่ือให้ได้มาตรฐานของประเทศคู่ค้าและ
มาตรฐานสากล ซึ่งคณะกรรมาธิการโครงการมาตรฐานอาหารขององค์การอาหารและเกษตรแห่ง
สหประชาชาติและองค์การอนามัยโลก (Codex Alimentarius Commission, CAC) ได้กำหนดระดับ
มาตรฐานความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์ต่างๆ ให้มีปริมาณไซยาไนด์อยู่ในผลิตภัณฑ์ไม่เกิน 10 มิลลิกรัมต่อ
กิโลกรมั น้ำหนักแหง้

จากรายงานของ Yeoh and Sun (2001) พบว่าหลงั กระบวนการผลติ แปง้ มีปริมาณไซยาไนดต์ กค้าง
ประมาณ 28 - 88 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมน้ำหนักแห้ง ซ่ึงแสดงให้เห็นว่ากระบวนการผลิตแป้งไม่สามารถลด
ปริมาณไซยาไนด์ตกค้างให้หมดไปได้ และ Albert et al. (2005) รายงานว่าแป้งฟลาวรจ์ ากมันสำปะหลังพันธุ์
เกษตรศาสตร์ 50 พันธุ์ระยอง 5 พันธุ์ระยอง 2 และพันธ์ุห้านาที มีปริมาณไซยาไนด์ตกค้างอยู่ 28.8 26.8
12.5 และ 8.3 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมน้ำหนักแห้ง ตามลำดับ สำหรับในประเทศไทยมีการใช้มันสำปะหลังพันธุ์
ระยอง 5 และพันธุห์ า้ นาทเี ป็นวัตถุดบิ ในการผลิตแป้งฟลาวร์ จากผลการวิจัยพบวา่ แป้งฟลาวรจ์ ากมันสำปะหลัง
พันธ์รุ ะยอง 5 ยงั คงมีปริมาณไซยาไนด์ที่เหลือตกค้างอยู่สูงกว่าคา่ มาตรฐานที่ 10 มิลลิกรัมตอ่ กิโลกรัมน้ำหนักแห้ง
อย่างไรก็ตาม แม้ว่ามันสำปะหลังพันธุ์ห้านาทีจะมีปริมาณไซยาไนด์น้อยแต่ก็มีปริมาณแป้งน้อยด้วยเม่ือเทียบ

เทคโนโลยีชวี ภาพเพอื่ การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพนั ธมุ์ นั สำปะหลัง 59

กับพันธ์ุการค้าอื่นๆ ดังน้ันจึงควรมีการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังท่ีมีไซยาไนด์ต่ำและมีผลผลิตแป้งสูง เพ่ือใช้
เปน็ วตั ถุดิบในอุตสาหกรรมผลติ แป้งฟลาวร์ สำหรับใช้เปน็ ส่วนผสมในอตุ สาหกรรมอาหาร

การปรับปรุงมันสำปะหลังที่ผ่านมา ใช้วิธีการแบบด้ังเดิมในการประเมินปริมาณแป้งและไซยาไนด์ใน
หัวเพื่อคัดเลือกหัวมันสำปะหลังน้ัน จะต้องรอจนถึงเวลาเก็บเกี่ยวที่ประมาณ 10 - 12 เดือน ซ่ึงใช้เวลานาน จึงจะ
ได้พันธุ์ที่มีลักษณะท่ีต้องการ เครื่องหมายโมเลกุล (Molecular marker) เป็นเครื่องมือหนึ่งที่ใช้เพ่ิม
ประสิทธิภาพการปรับปรุงพันธ์ุพืช ซึ่งมีประโยชน์อย่างมากในการค้นหายีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะทางการ
เกษตรที่สนใจ (candidate gene) อีกท้ัง ทำแผนที่ตำแหน่ง Quantitative Trait Loci (QTL) บนโครโมโซม
(QTL mapping) เพื่อใช้เป็นเคร่ืองหมายโมเลกุลคัดเลือกปรับปรุงพันธุ์พืชได้ (marker-assisted selection; MAS)
อย่างไรกต็ าม วิธกี าร QTL และ candidate gene ยงั มขี ้อจำกดั คือตอ้ งมกี ารสร้างประชาการ Recombinant
Inbred Line (RIL) ที่ได้จากการผสมพันธ์ุระหว่างพันธ์ุที่มีลักษณะทางการเกษตรท่ีแตกต่างกัน ซ่ึงใช้เวลานาน
หลายปจี งึ จะไดป้ ระชากรพืชมาศกึ ษา

ปัจจุบันจึงมีการนำเทคโนโลยี Genotyping-By-Sequencing (GBS) เพ่ือใช้ในการตรวจสอบจีโนไทป์
และความแตกต่างของลำดับเบส ณ ตำแหน่งใดๆ (single nucleotide polymorphisms; SNPs) มีความสามารถ
ในการคัดเลือกส่วนของจีโนมท่ีเก่ียวข้องกับยีนที่ทำงานอยู่ (active genes) ได้ การค้นหาเครื่องหมายโมเลกุล
ชนิด SNP ด้วยเทคโนโลยี GBS เป็นวธิ ีการค่อนข้างรวดเร็ว มีประสิทธิภาพ ประหยัดค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์
ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมในระดบั จีโนม จึงสามารถนำมาพัฒนาเป็นเคร่ืองมือสำหรับการปรับปรุงพันธุ์พืชได้
และประการสำคัญคือ สามารถใช้ประชากรพืชในธรรมชาติ (natural population) โดยไม่จำเป็นต้องสร้าง
ประชากรพืชเพื่อนำมาศกึ ษา จึงทำให้การศึกษาแบบ GBS ใช้เวลาน้อยกว่า และสามารถประเมินความสัมพันธ์
ทมี่ ีกบั ลกั ษณะทางการเกษตรท่สี นใจหลายลักษณะในคราวเดียวกันได้

จากงานวิจัยของสำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ กรมวิชาการเกษตร ได้ทำการวิเคราะห์จีโนไทป์
และเครื่องหมายโมเลกุลชนิดสนิประดับจีโนมด้วยเทคโนโลยี GBS ในมันสำปะหลังจำนวน 100 เช้ือพันธุ์จาก
แปลงรวบรวมศูนย์วิจัยพืชไร่ระยอง กรมวิชาการเกษตร และหาความสัมพันธ์ของสายพันธ์ุมันสำปะหลัง
สามารถค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลชนิดสนิปท่ีสัมพันธ์กับปริมาณไซยาไนด์ในหัวมันสำปะหลัง จำนวน 1 ชุด
ซง่ึ อยู่บนยนี Manes.16G005900 ที่อยู่บนโครโมโซมท่ี 16

เคร่ืองหมายโมเลกุลชนิดสนิปที่พัฒนาข้ึนนี้ สามารถแสดงจีโนไทป์ (genotype) ให้ผลถูกต้องตรงกับ
ผลฟีโนไทป์ (phenotype) คิดเป็นร้อยละ 73.33 และสามารถแยกมันสำปะหลังท่ีมีปริมาณไซยาไนด์ต่ำกว่า
250 mg Hydrogen cyanide (HCN)/kg นำ้ หนกั สดได้

กระบวนการในการนำเคร่ืองหมายโมเลกุลชนิดสนิปไปใช้คัดเลือกลักษณะไซยาไนด์ของมันสำปะหลัง
สามารถทำได้โดยการสกัดดีเอ็นเอจากใบมันสำปะหลังที่ต้องการตรวจสอบ นำมาเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอด้วย
ปฏิกิรยิ าพีซีอาร์โดยใช้ชุดเคร่ืองหมายโมเลกุลชนิดสนิปที่พฒั นาขนึ้ จากนั้นนำดีเอ็นเอท่ีเพิ่มปริมาณแล้ว ตรวจ
แยกแถบดีเอ็นเอดว้ ยวธิ อี ิเล็กโตรโฟรซี สิ ใน 3 เปอร์เซน็ ต์ อะกาโรสเจล

เทคโนโลยีชีวภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพันธม์ุ นั สำปะหลัง 60

การแปลผลจากการทำปฏิกิริยาพีซีอาร์ หากเกิดแถบดีเอ็นเอขนาด 265 189 และ 133 คู่เบส
มนั สำปะหลงั สายพนั ธ์ทุ ่ีทดสอบมีจีโนไทปช์ นิดเฮเทอโรไซกัส (heterozygous: AT) (รูปที่ 1) หากเกิดแถบดีเอ็นเอ
ขนาด 265 และ 133 คู่เบส มันสำปะหลังสายพันธ์ุที่ทดสอบมีจีโนไทป์ชนิดโฮโมไซกัส (homozygous: AA)
(รูปที่ 1) แปลผลได้วา่ มนั สำปะหลังสายพันธุ์เหล่านนั้ มปี รมิ าณไซยาไนด์สูงตงั้ แต่ 250 mg HCN/kg นำ้ หนกั สดขึ้นไป

เม่ือทำปฏิกิริยาพีซีอาร์ หากเกิดแถบดีเอ็นขนาด 265 และ 189 คู่เบส มันสำปะหลังสายพันธ์ุน้ัน
มีจีโนไทป์ชนิดโฮโมไซกัส (homozygous: TT) (รูปท่ี 1) ซ่ึงแปลผลได้ว่า มันสำปะหลังสายพันธุ์นั้นมีปริมาณ
ไซยาไนด์ตำ่ กวา่ 250 mg HCN/kg นำ้ หนกั สด

รปู ท่ี 1 ผลการตรวจสอบจีโนไทป์ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลชนิดสนิปที่พัฒนาขึ้น โดยใช้มันสำปะหลังสายพันธ์ุ
ที่มีปริมาณไซยาไนด์ต่ำกว่า 250 mg HCN/kg น้ำหนักสด (อัลลีล TT) และ มันสำปะหลังสายพันธ์ุท่ีมี
ปริมาณไซยาไนดส์ งู กวา่ 250 mg HCN/kg น้ำหนักสด (อัลลลี AT และ อลั ลีล AA) และผลการตรวจสอบจีโน
ไทป์ด้วยเครอ่ื งหมายโมเลกลุ ชนดิ สนปิ ทป่ี ระดิษฐข์ นึ้ โดยใชม้ ันสำปะหลังจำนวน 14 สายพันธ์ุ (lane 1 – 14)
เพ่ือใช้ในการตรวจสอบความใช้ไดข้ องเคร่อื งหมายโมเลกุลชนิดสนปิ ท่ปี ระดิษฐข์ ้ึน

เครอ่ื งหมายโมเลกุลชนิดสนปิ ท่ีสัมพันธก์ ับปริมาณไซยาไนด์ในหัวมันสำปะหลงั ท่พี ัฒนาข้นึ น้ี สามารถแยก
มั นสำป ะหลั งที่ มี ป ริมาณ ไซยาไนด์ ต่ ำกว่า 250 mg Hydrogen cyanide (HCN)/kg น้ ำหนั กสดได้
ตั้งแต่ในระยะต้นกล้า ซึ่งช่วยลดตน้ ทนุ และระยะเวลาในการคัดเลือกมันสำปะหลังท่มี ีลักษณะไซยาไนด์ต่ำ ทดแทน
การคัดเลือกแบบด้ังเดิมท่ีต้องรอจนถึงเวลาเก็บเก่ียวประมาณ 10-12 เดือน จึงสามารถประเมินปริมาณไซยาไนด์
จากหวั มนั สำปะหลังได้ อกี ทัง้ ข้นั ตอนการตรวจสอบไม่ย่งุ ยาก สามารถใชเ้ ครือ่ งมือทมี่ ีอยู่ในห้องปฏบิ ตั ิการ

เอกสารอา้ งอิง

Yeoh H.H. and F. Sun. 2001. Assessing cyanogen content in cassava-based food using the
enzyme-dipstick method. Food and Chemical Toxicology39: 649–653

Albert, L.C., K. Sriroth, and T.C. Huang. 2005. Proximate composition, mineral content,
hydrogen cyanide and phytic acid of 5 cassava genotypes. Food Chem. 92: 615-620

FAO/WHO. 1991. Joint FAO/WHO Food Standards Programme. Codex Alimentarius Commission XII,
Supplement 4, FAO, Rome, Italy.

เทคโนโลยชี ีวภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธม์ุ นั สำปะหลงั 61

การใชเ้ ครอ่ื งหมายดีเอ็นเอตรวจสอบลักษณะมนั สำปะหลงั แปง้ เหนียว (Waxy starch)
ดว้ ยวธิ ีพีซีอาร์ (PCR: Polymerase Chain Reaction)

อรโุ ณทัย ซาววา

เครื่องหมายดีเอ็นเอ (DNA marker)

เคร่ืองหมายดีเอ็นเอ (DNA marker) หมายถึง ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่ใช้เป็นเครื่องหมายติดตามหน่วย
พันธุกรรมหรือยีนของส่ิงมีชีวิตและสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นลูกหลานได้ เป็นลำดับ นิวคลีโอไทด์ช่วงหนึ่งของ
ดเี อ็นเอทใ่ี ช้เป็นเครอื่ งหมายบ่งช้คี วามเปน็ เอกลกั ษณ์ของส่ิงมชี ีวติ โดยอาจมีตำแหนง่ บนโครโมโซมในนิวเคลียส
(nuclear DNA) หรือในออร์แกเนลล์ (mitochondria DNA หรือ chloroplast DNA) ซึ่งสามารถถา่ ยทอดทาง
พันธุกรรมได้ พืชแต่ละชนิดแต่ละสายพันธ์ุมีการจัดเรียงตัวของลำดับนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลดีเอ็นเอท่ีเป็น
เอกลักษณ์และมีความแตกต่าง (polymorphisms) ของลำดับเบสในโมเลกลุ ดเี อ็นเอ ไม่วา่ จะเป็นการแทรกเข้า
(insertion) การตัดออก (deletion) การกลายพันธุ์เฉพาะจุด (point mutation) การเพิ่มจำนวน (duplication)
และการเคล่ือนย้ายตำแหน่ง (translocation) ของลำดับนิวคลีโอไทด์ ทำให้เกิดความแตกต่างของดีเอ็นเอ
(DNA polymorphisms) หมายถึง ความแตกต่างของลำดับดีเอ็นเอในแต่ละกลุ่มแยกหรือกลุ่มประชากร
ความแตกตา่ งในระดับดีเอ็นรวมถึงความความผันแปรตัง้ แต่คู่เบสเดียว หลายคู่เบส และลำดบั เบสซ้ำ ความผันแปร
ทางจีโนมสามารถสร้างเคร่ืองหมายไดห้ ลายรูปแบบ เช่น สนปิ ส์ (SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms)
จำนวนเบสซ้ำ (VNTRs: Variable number of tandem repeats) ทรานสโพซอน (transposable elements)
การปรับเปล่ียนโครงสร้างจีโนมและจำนวนซ้ำของดีเอ็นเอ เป็นต้น (Salwa, 2018) รูปแบบความแตกต่างของ
ดเี อ็นเอ (DNA polymorphisms) จึงทำให้สิ่งมีชีวิตมีความแตกต่างกัน สามารถนำมาตรวจสอบความแตกต่าง
หรือโพลีมอรฟ์ ิซึมของส่ิงมีชีวิตหรือสายพันธุ์พืชที่ต้องการตรวจสอบได้ จึงถูกนำมาใชป้ ระโยชน์อยา่ งแพรห่ ลาย
ในการศึกษาจีโนม และในวงการเกษตรได้แก่ การจัดจำแนกส่ิงมีชีวิตและการศึกษาความหลากหลายของ
สงิ่ มชี ีวิต การสร้างโพรบ (probe) เพื่อตรวจสอบโรค หรือตรวจสอบหาส่ิงที่ตอ้ งการ การสร้างแผนท่ีโครโมโซม
การหาตำแหน่งยีนทต่ี ้องการบนโครโมโซมและการแยกสกดั ยนี โดยอาศัยแผนท่ี และการใช้เคร่ืองหมายเพอ่ื ช่วย
คดั เลือกลกั ษณะทีส่ ำคญั และลกั ษณะทใี่ ช้วิธียงุ่ ยากในการคัดเลอื ก (อรรัตน์, 2548)

การจำแนกเครือ่ งหมายดเี อ็นเอ
เครอ่ื งหมายดเี อ็นเอถูกจำแนกตามลักษณะพื้นฐาน ดงั นี้
1. เครื่องหมายดีเอ็นเอจำแนกตามหน้าท่ีของยีน มี 2 ประเภท คือ เครื่องหมายดีเอ็นเอแบบ ข่มร่วม

(co-dominant marker) จะปรากฏแถบเครื่องหมายดีเอ็นเอขนาดแตกต่างกัน สามารถแยกระหว่างต้นที่มี
พนั ธุกรรมแบบ homozygous และ heterozygous ได้ และเครอ่ื งหมายดีเอน็ เอแบบข่มสมบูรณ์ (dominant marker)

เทคโนโลยีชีวภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพนั ธมุ์ นั สำปะหลงั 62

จะให้แถบเครื่องหมายดีเอ็นเอแบบปรากฏและไม่ปรากฏ ซึ่งไม่สามารถแยกพันธุกรรมแบบ homozygous
และ heterozygous ได้ (Collard et al., 2005)

2. เครื่องหมายดีเอ็นเอจำแนกตามลักษณะการถ่ายทอด (Transmission) ได้แก่ การถ่ายทอด
พันธุกรรมผ่านทางนิวเคลียร์จากพ่อและแม่ (biparental nuclear inheritance) การถ่ายทอดพันธุกรรมทาง
นิวเคลียร์จากแม่ (maternal nuclear inheritance) การถ่ายทอดพันธุกรรมผ่านทางออร์แกเนลจากแม่
(maternal organelle inheritance) หรือ การถ่ายทอดพันธุกรรมผ่านทางออร์แกเนลจากพ่อและแม่
(parental organelle inheritance) เปน็ ต้น (Semagn et al., 2006)

3. เครอ่ื งหมายดีเอ็นเอจำแนกตามวธิ กี ารตรวจวิเคราะห์ แบ่งเปน็ 3 ประเภท
3.1 เคร่ืองหมายดีเอ็นเอท่ีได้จากการวิเคราะห์ด้วยวิธีไฮบริไดเซช่ัน (Hybridization-based

markers) ได้แก่ เทคนิค RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
3.2 เคร่ืองหมายดีเอ็นเอที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยวิธีพีซีอาร์ (PCR-based markers) เช่น เทคนิค

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
SSR (Simple Sequence Repeats) หรือไมโครแซทเทลไลท์ (microsatellites), cpSSRs (Chloroplast
microsatellites), mtDNA (Mitochondrial microsatellites), RAMP (Randomly Amplified Microsatellite
Polymophism), ISSR ( Inter Simple Sequence Repeat), SRAP (Sequence-related Amplified
Polymorphism), Retrotransposons, IRAP (Inter-retrotransposon), Amplified Polymorphism), REMAP
(Retrotransposon Microsatellite Amplification Polymorphism), RBIP (Retrotransposon-based Insertion
Polymorphism), iPBS (Inter-primer Binding Site), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)
และ SCAR (Sequence-characterized Amplified Regions) เป็นตน้

3.3 เคร่ืองหมายดีเอ็นเอท่ีได้จากการวิเคราะห์ด้วยวิธีการหาลำดับเบส (Sequence-based
markers) ได้แก่ เคร่ืองหมาย SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) โดยใช้เทคนิค Sanger method of
sequencing, Pyrosequencing, NGS (Next-generation sequencing), GBS (Genotyping by sequencing)
และ DArT Seq (Diversity array technology) เปน็ ตน้ (Collard et al., 2005)

มนั สำปะหลังแป้งเหนียว (Waxy starch)

มันสำปะหลัง (Manihot esculenta Cranz) มีชื่อสามัญเรียกหลายช่ือตามภาษาต่างๆ ท่ีได้ยินกัน
มากได้แก่ Cassava, Yuca, Mandioa, Manioc, Tapica เป็นต้น (จรงุ สิทธ,์ 2547) เปน็ พืชอาหารที่สำคัญเป็น
อันดับที่ 5 ของโลกรองจากข้าวสาลี ข้าวโพด ข้าว และมันฝร่ัง เป็นพืชอาหารท่ีสำคัญของประเทศในเขตร้อน
โดยเฉพาะประเทศต่างๆ ในทวีปอัฟริกา และทวีปอเมริกาใต้ ประเทศไทยมีพื้นท่ีปลูกมันสำปะหลัง มากเป็น
อันดับที่สร่ี องจากข้าว ข้าวโพด และยางพารา แหล่งปลกู มนั สำปะหลังที่สำคัญท่ีสุดของประเทศในปัจจุบัน คือ
ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ รองลงมาคือภาคกลาง การผลิตมันสำปะหลังน้ันต้องมีการคัดเลือกพันธ์ุท่ีเหมาะสม

เทคโนโลยีชีวภาพเพอื่ การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธมุ์ นั สำปะหลัง 63

ต่อสภาพพื้นที่ และภูมิอากาศของแต่ละประเทศ เพ่ือให้ได้ผลผลิตท่ีดี ประเทศไทยมีความสามารถในการ
แข่งขันสูงในตลาดแป้งมันสำปะหลัง เน่ืองจากแป้งมันสำปะหลังเป็นส่ิงที่สำคัญที่สุดของผลิตภัณฑ์ทั้งหมดท่ีได้
จากมันสำปะหลัง เป็นวัตถุดิบที่สำคัญในการผลิตพลังงานทดแทนของทั้งมนุษย์และสัตว์ นอกจากนี้ยังถูก
นำมาใช้ในวงการอุตสาหกรรมการผลติ ไบโอพอลิเมอร์อีกด้วย ทัง้ น้ีแป้งมันสำปะหลังเป็นสิ่งที่สกัดออกมาได้ง่าย
อย่างไรก็ตาม มันสำปะหลังถูกจัดให้เป็นแหล่งกำเนิดของแป้งที่สำคัญเป็นอันดับสองของโลก ฉะนั้นผู้ผลิตมัน
สำปะหลังยังคงจะต้องแข่งขันกับผู้ผลิตแป้งชนิดอื่นอีก เช่น แป้งข้าวโพด ซึ่งตามความเชื่อแล้วมีความสำคัญ
มากกว่า ส่ิงหนึ่งท่ีน่าสนใจก็คือ ความเหมือนกันระหว่างแป้งข้าวโพดกับแป้งมันสำปะหลัง ปัจจัยที่สำคัญที่สุด
ในการรักษาความสามารถในการแข่งขันของประเทศไทยในฐานะผู้นำด้านการผลิตมันสำปะหลัง คือ ปริมาณ
ผลิตผลต่อไร่ ส่วนในการเพิ่มขีดความสามารถในการแข่งขัน และยกระดับแป้งมันสำปะหลังให้เหนือกว่าแป้ง
ชนิดอื่นนั้น ส่ิงที่สำคัญที่สดุ ก็คอื การปรบั ปรุงคุณภาพของแป้งมันสำปะหลัง จุดเรมิ่ ต้นท่นี า่ สนใจท่ีสุด คอื ความ
หลากหลายทางพันธุกรรมท่ีทำให้มันสำปะหลังแต่ละชนิดมีความแตกต่างกัน หน่ึงในนั้นคือพันธุ์แป้งเหนียว
(waxy starch) ซ่ึงสหรัฐอเมริกาได้ใช้ประโยชน์เป็นคร้ังแรกโดยพบในข้าวโพด ดังนั้นอุตสาหกรรมแป้งทั่วโลก
ได้ทุ่มเทอย่างจริงจังในการค้นหามันสำปะหลัง พันธ์ุท่ีได้ช่ือว่าเป็น waxy ซึ่งตัวแป้งไม่มีสารอะไมโลส
(amylose-free) มันสำปะหลังพันธุ์ waxy แตกต่างจากมันสำปะหลังทั่วไป คือ สามารถละลายน้ำได้ดีกว่า มี
ความเหนียวข้นมากกว่า และมีการคืนตัวต่ำกว่า ซ่ึงแป้งเหนียว (waxy starch) เป็นวัตถุดิบสำหรับเพิ่มความ
หนืดในอตุ สาหกรรมอาหาร มีความต้องการสูงในสหรัฐอเมริกา การใช้แป้งมนั สำปะหลงั ต้องเข้าสู่กระบวนการ
ดัดแปลงทางเคมีเสียก่อนเพ่ือให้เน้ือแป้งที่ได้มีลักษณะเหนียว ทั่วโลกจึงหันมาใช้แป้งจากข้าวโพดข้าวเหนียว
เพราะแป้งเหล่านี้ไม่ต้องนำมาเข้าสู่กระบวนการดัดแปลงจากสารเคมีแต่มีต้นทุนสูง ดังน้ันศูนย์เกษตรเขตร้อน
นานาชาติ (CIAT) มองวา่ หากมนั สำปะหลังสามารถให้เนื้อแปง้ เหนยี วได้ จะเปน็ การเพ่ิมมูลคา่ ได้เปน็ อยา่ งมาก

แป้งเหนียว (waxy starch) เป็นวัตถุดิบสำหรับเพ่ิมความหนืดในอุตสาหกรรมอาหาร มีความต้องการ
สงู ในสหรัฐอเมริกา การใช้แป้งมันสำปะหลังต้องเข้าสู่กระบวนการดดั แปลงทางเคมีเสียก่อนเพื่อใหเ้ น้ือแป้งท่ีได้
มีลักษณะเหนียว ทั่วโลกจึงหันมาใช้แป้งจากข้าวโพด ข้าวเหนียว เพราะแป้งเหล่านี้ไม่ต้องนำมาเข้าสู่
กระบวนการดัดแปลงจากสารเคมีแต่มีต้นทุนสูง แต่แป้งเหนียวที่ได้จากมันสำปะหลังเป็นเพียงหนึ่งเดียวที่ตัว
แป้งไม่แยกตัวออกจากน้ำเม่ือเก็บรักษาไว้ท่ีอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส นาน 5 สัปดาห์ เม่ือเทียบกับแป้ง
เหนียวที่ได้จากข้าวโพด ข้าว และมันฝร่ัง จึงเหมาะกับอุตสาหกรรมที่ต้องผ่านการแช่เย็น และจุดเหยือกแข็ง
มากกว่า (Sanchez et al., 2010) ดังนั้นศูนย์เกษตรเขตร้อนนานาชาติ (CIAT) มองว่าหากมันสำปะหลัง
สามารถใหเ้ น้อื แป้งเหนียวได้ จะเป็นการเพ่ิมมูลค่าได้เป็นอยา่ งมาก เนอ่ื งจากมันสำปะหลงั พันธ์ุ waxy แตกต่าง
จากมันสำปะหลังทั่วไป คือ สามารถละลายน้ำได้ดีกว่า มีความเหนียวข้นมากกว่า และมีการคืนตัวต่ำกว่า
(Nakasathien, 2009) ลักษณ ะแป้งเหนียว waxy หรือ amylose-free เกี่ยวข้องกับยีน GBSSI (The
granule-bound starch synthase) ซึ่งยีนดังกล่าวเป็นเอ็นไซม์ที่ช่วยในการสังเคราะห์ และสะสมแป้งในพืช
ทำหน้าท่ีโดยตรงในการสังเคราะห์แป้งชนิดอะไมโลส และยังส่งผลต่อโครงสร้างของอะไมโลแพคตินด้วย

เทคโนโลยชี ีวภาพเพ่ือการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพนั ธมุ์ นั สำปะหลัง 64

(Merida et al., 1999) การปรับปรุงพันธ์ุมันสำปะหลังทางด้านคุณภาพของแป้งมีความสำคัญอย่างมาก
เน่ืองจากสามารถประยุกต์ใช้ในระดับอุตสาหกรรมได้อย่างกว้างขวาง การพัฒนาลักษณะแป้งเหนียวในมัน
สำปะหลังจึงเป็นอีกทางเลือกหนึ่ง ที่มีความต้องการมากขึ้น การสะสมของแป้งชนิดอะไมโลส จากการศึกษา
การแสดงออกของยีน GBSSI หากมีการแสดงออกที่ต่ำมาก (down-regulation) ก็จะมีการสะสมอะไมโลส
ต่ำลงเช่นกนั จึงมีการพัฒนามันสำปะหลังดัดแปลงพันธุกรรมด้วยเทคนิค RNAi ในการยับย้ังการแสดงออกของ
ยีนดังกล่าว พบว่า มันสำปะหลังที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมมีอะไมโลสแค่เพียง 5 เปอร์เซ็นต์ เม่ือเทียบกับ
ต้นปกติที่มีอะไมโลสถึง 25 เปอร์เซ็นต์ ทำให้การสะสมของอะไมโลส ส่งผลให้แป้งในมันสำปะหลังมีลักษณะ
แป้งเหนียวขึ้น (Zhao et al., 2011) อย่างไรก็ตามมันสำปะหลังท่ีได้รับการดัดแปลงพันธ์ุกรรมในการยับยั้ง
การแสดงออกของยีน GBSSI เม่ือนำมาเปรียบเทียบกับพันธ์ุท่ีให้ลักษณะแป้งเหนียวตามธรรมชาติ พบว่ามี
นำ้ หนักโดยรวมของเม็ดแปง้ ชนดิ อะไมโลแพคตินท่ีต่ำกว่าพนั ธ์ปุ กติ (Rolland et al., 2013)

ปัจจุบันการใช้เครื่องหมายโมเลกุลถูกนำมาช่วยในการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์พืช เคร่ืองหมาย
โมเลกุลท่ีนิยมนำมาศึกษาลักษณะจีโนไทป์แบบข่มร่วมกัน (codominance) ได้แก่ เทคนิคไมโครแซทเทลไลท์
(microsatellite) หรือ SSR (Simple Sequence Repeat) หมายถึง ดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสซ้ำ (repetitive DNA)
เรียงอยู่ต่อเน่ืองกันบนจีโนม แต่ละชุดประกอบด้วยเบสซ้ำตั้งแต่ 1-6 เบส กระจายตัวท้ังจีโนมแต่การกระจายไม่
สม่ำเสมอ ทำให้เกิดความหลากหลาย และนอกจากน้ียังมีเทคนิค SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
ท่ีสามารถแสดงแถบดีเอ็นเอแบบข่มร่วมกันและสามารถแยกความแตกต่างระหว่างโฮโมไซโกตและเฮเทอโรไซโกต
ได้ (สุรินทร์, 2552) Aiemnaka et al. (2012) ได้ศึกษาลักษณะของยีนท่ีควบคุมลักษณะแป้งเหนียวใน
มันสำปะหลัง พบว่า เป็นลักษณะด้อย (recessive) wxwx จากการศึกษายีน GBSSI บนโครโมโซมมันสำปะหลัง
แป้งเหนียวกับแป้งปกติ และพบมีตำแหน่ง SNPs ที่สามารถจำแนกลักษณะ waxy (wxwx) และ non waxy
(WxWx, Wxwx) ออกจากกันได้

วธิ ีการตรวจสอบลักษณะมันสำปะหลังแป้งเหนยี ว (Waxy starch) โดยใช้เคร่ืองหมายดเี อ็นเอด้วยวธิ ีพีซีอาร์
(PCR: Polymerase Chain Reaction)

กรมวิชาการเกษตร เป็นแหล่งรวบรวมพันธุ์มันสำปะหลังท่ีสำคัญแห่งหน่ึงของประเทศไทยมีพันธ์ุ
มนั สำปะหลงั ที่มีความหลากหลายทางพันธุกรรม ดังนั้นการใช้เคร่ืองหมายดีเอ็นเอตรวจสอบลักษณะมนั สำปะหลัง
แป้งเหนียว (Waxy starch) ด้วยวิธีพซี ีอาร์ (PCR: Polymerase Chain Reaction) จึงเปน็ อีกทางเลือกหนงึ่ ใน
การช่วยคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังแป้งเหนียวได้ ซึ่งมีขั้นตอนสรุปได้ดังภาพที่ 1 และมี
รายละเอยี ดดังตอ่ ไปนี้

เทคโนโลยชี ีวภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพนั ธมุ์ นั สำปะหลงั 65

1. เก็บตัวอยา่ งพนั ธุม์ ันสำปะหลงั จากแหลง่ รวบรวมพนั ธุข์ องกรมวิชาการเกษตร

2. สกัดดีเอน็ เอด้วยวธิ ี CTAB

3. เพิ่มปริมาณดเี อ็นเอดว้ ยวิธพี ีซีอาร์ (PCR: Polymerase Chain Reaction)

4. ตรวจสอบแถบดีเอน็ เอด้วยวิธีเจลอิเล็คโตรโฟรซี สิ
ภาพท่ี 1 แผนผังสรุปขั้นตอนการใชเ้ ครอ่ื งหมายดีเอ็นเอสำหรับการตรวจสอบและคัดเลือกลักษณะแป้งเหนียว

(Waxy starch) ในมนั สำปะหลงั

ข้นั ตอนวิธกี าร
1. การเก็บตวั อยา่ งพันธ์ุมนั สำปะหลังจากแหล่งรวบรวมพันธ์ขุ องกรมวิชาการเกษตร

ทำการตัวอย่างใบมันสำปะหลังจากแปลงปลูกในแหล่งรวบพันธ์ุของกรมวิชาการเกษตร ณ ศูนย์วิจัย
พชื ไร่ระยอง (ภาพที่ 2) จำนวน 758 ตัวอยา่ ง นำมาเก็บรกั ษาตวั อย่างใบไวท้ อ่ี ณุ หภมู ิ -20 องศาเซลเซียส หรือ
แบ่งเก็บแบบแห้งโดยนำใบมันสำปะหลังผึ่งลมนาน 1 สัปดาห์ แล้วเก็บรักษาไว้ในตู้เก็บตัวอย่างอุณหภูมิ 4
องศาเซลเซียส

CMR3 CMR

ภาพที่ 2 ตัวอย่างใบสดมันสำปะหลังท่ีนำมาสกัดดีเอ็นเอ (ทมี่ า: อรโุ ณทยั และคณะ, 2552)

เทคโนโลยชี วี ภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพนั ธม์ุ นั สำปะหลัง 66

2. การสกดั ดเี อ็นเอจากใบมนั สำปะหลงั ด้วยวธิ ี CTAB
นำมันใบสำปะหลังมาสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี CTAB ตามวิธีของอรุโณทัยและคณะ (2552) ดังนี้เตรียม

Extraction buffer [20 mM sodium EDTA and 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4 M NaCl, 2%(W/V) CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide)] เติม 0.2% β-mercaptoethanol กอ่ นใช้บม่ ท่ี 60 องศาเซลเซียส
ชั่งใบมนั สำปะหลัง 5 กรัม บดในโกร่งด้วยไนโตรเจนเหลวให้ละเอียดจนเป็นผงแป้ง ใส่หลอด 15 มิลลิลติ ร เติม
Extraction buffer 5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน บ่มท่ี 60 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง (นำมาเขย่าทุก 20 นาที)
แล้วนำตัวอย่างออกมาวางที่อุณหภูมิห้องนาน 10 นาที แล้วเติม Choroform:Isoamyl alcohol (24:1)
5 มิลลิลิตร ผสมกลับหลอดไปมา 10 นาที นำไปปั่นเหวี่ยงท่ี 4 องศาเซลเซียส ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที
นาน 10 นาที ดดู น้ำใส 750 ไมโครลิตร ใส่ในหลอด 1.5 มิลลลิ ิตร เติม Choroform:Isoamyl alcohol (24:1)
750 ไมโครลิตร ผสมกลับหลอดไปมา 5 นาที นำไปปั่นเหวี่ยงท่ี 12,000 รอบตอ่ นาที นาน 10 นาที ดดู นำ้ ใสใส่
หลอด 1.5 มิลลิลิตรหลอดใหม่ เติม 3M NaOAC 0.1 เท่า และ Isopropanol 0.6 เท่า แล้วนำไปตกตะกอน
ดีเอ็นเอที่ -20 องศาเซลเซยี ส นาน 30 นาที นำไปป่ันเหว่ยี งท่ี 4 องศาเซลเซยี ส ความเร็ว 12,000 รอบตอ่ นาที
นาน 10 นาที เทน้ำใสทิง้ ล้างตะกอนดีเอ็นเอด้วย 70% Ethanol 750 ไมโครลิตร สองคร้ัง ทิ้งตะกอนดีเอน็ เอ
ให้แห้งแล้วละลายด้วย TE 100 ไมโครลิตร และเติม RNaseA (10 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) 4 ไมโครลิตร บ่มที่ 37
องศาเซลเซียสนาน 30 นาที นำไปวัดค่า (O.D) โดยใช้เคร่ือง spectrophotometer ที่ความยาวคล่ืน
A260/A280 ให้อยู่ในช่วง 1.8-2.0 แล้วเจือจางให้ได้ความเข้มข้น 50 นาโนกรัม/ไมโครลิตร เพ่ือนำไปทำ
ปฏกิ ิริยา PCR เก็บดเี อ็นเอที่ -20 องศาเซลเซียส

เมื่อนำไปดีเอ็นเอไปวัดค่า (O.D) ด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น A260/A280

อยใู่ นชว่ ง 1.8 - 2.0 (ภาพท่ี 3)

ภาพท่ี 3 ตวั อย่างดีเอน็ เอของมนั สำปะหลงั ที่สกดั ดว้ ยวิธี CTAB บนเจลอะกาโรส 1 เปอร์เซน็ ต์

เทคโนโลยีชวี ภาพเพอื่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพันธมุ์ นั สำปะหลัง 67

3. การเพม่ิ ปรมิ าณดีเอ็นเอด้วยวิธีพซี ีอาร์ (PCR: Polymerase Chain Reaction)
3.1 ไพรเมอรท์ ี่ใชใ้ นการทดลอง
ใช้ไพรเมอร์ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะแป้งเหนียวในมันสำปะหลังตามรายงานของ Aiemnaka และคณะ

(2012) เปน็ ตำแหน่ง C/G (หมายเลข 3 ภาพท่ี 4) และมีลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ดงั แสดงในตารางท่ี 1
ซึ่งการใช้เคร่ืองหมายโมเลกุลตรวจสอบลักษณะมันสำปะหลังแป้งเหนียว (Waxy starch) ด้วยวิธีพีซีอาร์
จำเป็นต้องมีแถบดีเอ็นเออ้างอิง ซึ่งการทดลองนี้ได้ไพรเมอร์สากลจากยีน RbcL สำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ
อ้างอิง ซึ่งยีนดังกล่าวออกแบบมาจากส่วนอนุรักษ์ของยีนจากจีโนมชนิดคลอโรพลาสต์ ให้แถบดีเอ็นเอเพียง
1 แถบ สามารถใชไ้ ด้กบั พืชทุกชนดิ (Paween et al., 2011)

ภาพที่ 4 ตำแหน่งเคร่ืองหมายดีเอ็นเอที่ท่ีเก่ียวข้องกับลักษณะแป้งเหนียวในมันสำปะหลังตามรายงานของ
Aiemnaka และคณะ (2012)

ตารางท่ี 1 ไพรเมอร์ท่ีใช้ในการตรวจสอบลักษณะแป้งเหนยี วด้วยวิธีพซี ีอาร์

ชือ่ ไพรเมอร์ ลำดับนวิ คลโี อไทด์ (5’-3’) เอกสารอ้างองิ
ไพรเมอร์สำหรบั เอน็ เออ้างองิ
ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC Paween et al., 2011
rbcL_F CTTCGGCACAAAATAAGAAACGATCTC Paween et al., 2011
rbcL_R
ไพรเมอรส์ ำหรบั อลั ลลี C (GC)ATGTTGAAGTAAGTAAAGATGC Aiemnaka et al., 2012
TGCTCAAGGCGTGGGAACGT Aiemnaka et al., 2012
F2
RN (GC)ATGTTGAAGTAAGTAAAGATGG Aiemnaka et al., 2012
ไพรเมอร์สำหรับอลั ลลี G TGCTCAAGGCGTGGGAACGT Aiemnaka et al., 2012
F4
RN

เทคโนโลยีชวี ภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพันธม์ุ นั สำปะหลงั 68

3.2 การเพ่ิมปริมาณดเี อน็ เอด้วยวธิ ีพีซีอาร์
เตรียมส่วนผสมปฏิกิริยาพีซีอาร์โดยใช้น้ำยา Green Gotaq® Flexi (Promega, USA) ดังน้ี ดีเอ็นเอ

ต้นแบบ (100 นาโนกรัม/ไมโครลิตร) ปริมาตร 1 ไมโครลิตร บัฟเฟอร์ 5X Green Gotaq® Flexi ปริมาตร 5
ไมโครลิตร 25 mM MgCl2 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร 2 mM dNTP ปริมาตร 2 ไมโครลิตร ไพรเมอร์ forward
(5uM) ปริมาตร 1 ไมโครลิตร ไพรเมอร์ reverse (5uM) ปริมาตร 1 ไมโครลิตร Gotaq DNA polymerase
(5 ยูนิตต่อไมโครลิตร) ปริมาตร 0.15 ไมโครลิตร ในปฏิกิริยาปริมาตรท้ังหมด 25 ไมโครลิตร โดยต้ังโปรแกรม
การทำงานของเครอื่ ง thermal cycle, Gene Amp 9700 ตามขัน้ ตอนดังนี้

ขั้นตอน อณุ หภูมิ เวลา จำนวน cycles
Initial denaturation 94 °C 3 นาที 1 cycle
Denaturation 94 °C 30 วนิ าที
Annealing 55 °C 30 วินาที 35 cycle
Extension 72 °C 30 วนิ าที
Final extension 72 °C 7 นาที 1 cycle

4. การตรวจสอบแถบดเี อ็นเอด้วยวิธเี จลอเิ ล็คโตรโฟรีซีส
ทำการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอจากผลผลิตพีซีอาร์ด้วยวิธีเจลอิเล็คโทรโฟรีซีส (gel electropholesis)

โดยหยดผลผลิตพีซีอาร์ 4 ไมโครลิตร ลงในแผน่ วุ้นอะกาโรสเจล 1 เปอร์เซ็นตใ์ น 1xTBE buffer ใช้แรงเคล่ือน
ไฟฟ้า 100 โวลต์ เป็นเวลา 60 นาที ย้อมด้วยเอธิเดียมโบรไมด์ บันทึกแถบดีเอ็นเอด้วยชุดถ่ายภาพ UV
Transilluminators (BIORAD)

จากการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธีพีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์ Aiemnaka และคณะ (2012) พบว่าไม่
สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแบบรวมไพรเมอร์หลายคู่ได้ จึงเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแบบแยกหลอดทดลอง เม่ือได้
ปฏิกิริยาท่ีเสร็จสมบรูณ์แล้วนำมารวมเป็นหลอดเดียวกัน แล้วตรวจสอบแถบดีเอ็นเอบนเจลอะกาโรส จะ
ปรากฏแถบดีเอ็นเอ จำนวน 1 และ 2 แถบ จำนวนแถบดีเอ็นเอ 2 แถบ หมายถึงสามารถเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ
ของอัลลีล C หรอื G (ภาพท่ี 3) โดยใช้พันธุ์มันสำปะหลังแป้งเหนียว หรอื waxy จากมูลนิธิมันสำปะหลังแห่ง
ประเทศ จำนวนสองสายพันธุ์ คือ HB1 และ HB3 เป็น Positive control การตรวจสอบลักษณะแป้งเหนียว
พบว่า มันสำปะหลังแป้งเหนียว หรือ waxy จะสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้เฉพาะ Allele G มีลักษณะจีโน
ไทป์เป็นแบบลักษณะด้อย (wxwx) สำหรบั มนั สำปะหลังทไี่ ม่ใช่แป้งเหนียว หรอื non waxy จะให้แถบดีเอ็นเอ
เฉพาะ Allele C เป็นลักษณะเด่น (WxWx) และหากปรากฎท้ัง 2 อัลลีล คือจีโนไทป์ลักษณะ Co-dominant
ซ่งึ ไพร์เมอร์ทัง้ 3 คู่ ใช้ตรวจสอบดีเอน็ เอจากมันสำปะหลงั จำนวน 758 ตวั อย่าง ดว้ ยวิธีพซี ีอาร์ตอ่ ไป

เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพันธมุ์ นั สำปะหลงั 69

ภาพท่ี 5 แถบดเี อน็ เอท่ีได้จากการเพิ่มปริมาณดเี อน็ เอด้วยไพรเมอร์สำหรับตรวจสอบอลั ลีล C และ G รว่ มกับยีน
อา้ งองิ RbcL บนอะกาโรสเจล 1 เปอร์เซน็ ต์

การตรวจสอบลักษณะแป้งเหนียวในมันสำปะหลังโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลด้วยวิธีพีซีอาร์ กับ
ตัวอย่างมันสำปะหลังจำนวน 758 ตัวอย่าง พบจีโนไทป์แบบลักษณะเด่น (dominant: WxWx) ลักษณะข่มร่วม
(co-dominant: Wxwx) และลักษณ ะด้อย (recessive: wxwx) จำนวน 522 202 และ 17 ตัวอย่าง
ตามลำดบั ซึ่งการตรวจสอบลักษณะแป้งเหนียวเป็นการใช้เคร่ืองดีเอ็นเอชนิด SNPs สามารถทำได้หลายวิธี แต่
วิธพี ีซอี าร์มีขอ้ ดีและขอ้ ด้อยดงั แสดงในตารางที่ 2

ตารางที่ 2 ข้อดีและขอ้ ด้อยของการใช้เคร่ืองหมายดีเอ็นเอดว้ ยวิธพี ีซอี าร์

ข้อดี ข้อด้อย

• มขี ้ันตอนท่งี ่ายไม่ซบั ซอ้ น • ตอ้ งอาศยั ความชำนาญในการอ่านผลดว้ ยตาเปล่า

• สามารถอา่ นผลดว้ ยตาเปลา่ • ไม่สามารถตรวจสอบได้จำนวนมากต่อครั้งแบบ

• สารเคมีราคาถูก High-throughput ได้

• ใช้เคร่ืองอุปกรณ์เคร่ืองมือวิทยาศาสตร์ท่ีมีราคา

ถกู กว่าวิธีอื่น

• เหมาะสมกับห้องปฎิบัติการขนาดเล็กที่มี

เครอ่ื งมอื วทิ ยาศาสตร์เบี้องตน้ ท่ัวไป

เอกสารอ้างองิ

จรุงสิทธ์ ล่ิมศิลา และคณะ. 2547. เอกสารวิชาการ มันสำปะหลัง. สถาบันวิจัยพืชไร่ กรมวิชาการเกษตร
จตจุ ักร กรงุ เทพฯ. 124 หน้า.

สุรินทร์ ปิยะโชคณ ากุล. 2552. เครื่องหมายดีเอ็นเอ : จากพ้ืนฐานสู่การประยุกต์. สำนักพิมพ์
มหาวทิ ยาลัยเกษตรศาสตร์ ถนนพหลโยธนิ จตจุ ักร กรงุ เทพฯ. 269 หน้า

อรรัตน์ มงคลพร. 2548. เครื่องหมายโมเลกุลเพื่อการปรบั ปรงุ พันธพ์ุ ชื . กรุงเทพฯ: จรลั สนิทวงศ์ การพิมพ.์ 95 หนา้ .

เทคโนโลยชี ีวภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพันธม์ุ นั สำปะหลัง 70

อรุโณทัย ซาววา สุภาวดี ง้อเหรียญ อัญชลี ศรีสุวรรณ ประพิศ วองเทียม และหทัยรัตน์ อุไรรงค์. 2552.
การศึกษาความหลากหลายของพันธ์ุมันสำปะหลังในประเทศไทยโดยใช้เทคนิค SCAR (Sequence
Characterized Amplified Region). รายงานผลงานวิจัยประจำปี 2551-2552 สำนักวิจัยพัฒนา
เทคโนโลยีชีวภาพ กรมวชิ าการเกษตร. หนา้ 96-118.

Collard, B.C.Y., M.Z.Z. Jahufer, J.B. Brouwer, and E.C.K. Pang. 2005. An introduction to markers,
quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement:
The basic concepts. Euphytica 142: 169–196

Merida, A., J.M. Rodriguez-Galan, C. Vincent and J.M. Remero. 1999. Expression of the
Granule-Bound Starch Synthase I (Waxy) Gene from Snapdragon Is Developmentally
and Circadian Clock Regulated. Plant Physiol. 120(2): 401-410.

Nakasathien Sutkhet. 2009. Development of Innovative Trait of Thai Waxy-Starch Cassava
Variety for Industrial Uses and Export. Thai Tapioca Starch Association 2009. 3 pages

Parveen, I., H.K. Signh., S. Raghuvanshi and U.C. Pradhan. 2011. DNA barcoding of endangered
Indian Paphiopedilum species. Molecular Ecology Resources. Doi:10.1111/j.1775-
0998.2011.03071.x. 9 pages.

Rolland, A., T. Sanchez, A. Buleon, P. Colonna, H. Ceballos, S. Zhao, P. Zhang and D. Dufour. 2013.
Molecular and supra-molecular structure of waxy starches developed from cassava
(Manihot esculenta Crantz). Carbohydrate Polymers, Vol. 92, Issue 2, Pages 1451-1462.

Salwa, T. 2018. DNA Polymorphisms: DNA-Based Molecular Markers and Their Application in
Medicine, Genetic Diversity and Disease Susceptibility, Yamin Liu, IntechOpen, DOI:
10.5772/intechopen.79517. Available from: https://www.intechopen.com/books/
genetic-diversity-and-disease-susceptibility/dna-polymorphisms-dna-based-molecular-
markers-and-their-application-in-medicine

Sanchez, T., D. Dufour, I.X. Moreno and H. Ceballos. 2010. Comparison of Pasting and Gel
Stabilities of Waxy and Normal Starches from Potato, Maize, and Rice with Those
of a Novel Waxy Cassava Starch under Thermal, Chemical, and Mechanical Stress.
J. Agric. Food Chem., 58 (8): 5093–5099.

Semagn, K., A. Bjornstad and M. Ndjiondjop. 2006. An overview of molecular marker methods
for plants. African Journal of Biotechnology 525: 2540-2568.

Zhao, s., H. Ceballos, D. Dufour, T. Sanchez and P. Zhang. 2011. Development of waxy
cassava with different biological and physio-chemical characteristics of starches for
industrial applications. Biotechnol, Bioeng 108(8): 1925-1935.

เทคโนโลยชี วี ภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลอื กพนั ธมุ์ นั สำปะหลงั 71

การพัฒนาเครือ่ งหมายโมเลกุลจากยีนท่ีเกยี่ วขอ้ งกบั ลักษณะผลผลิตมนั สำปะหลงั

วิภาวี ช้นั โรจน์

ความต้องการพืชอาหารของโลกได้ขยายตัวเพิ่มข้ึนอย่างรวดเร็ว มันสำปะหลังเป็นพืชอาหารท่ีมี
ปริมาณแป้งสูงและมีราคาถูกกว่าพืชอาหารที่ให้แป้งประเภทอื่น และสามารถนำไปใช้ประโยชน์ได้หลายอย่าง
ได้แก่ อาหารสำหรับมนุษย์ อาหารเล้ียงสัตว์ วัตถุดิบในการผลิตเอทานอลเพื่อใช้เป็นพลังงานชีวภาพ และเป็น
วัตถุดิบหลักในภาคอุตสาหกรรม เช่น อุตสาหกรรมกระดาษ อุตสาหกรรมอาหาร ส่งผลให้ความต้องการมัน
สำปะหลังในตลาดโลกเติบโตอย่างต่อเน่ือง ในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา ประเทศไทยได้ขยายพื้นที่เพาะปลูก
มันสำปะหลังอย่างต่อเน่ือง เพื่อรองรับการเติบโตของอุตสาหกรรมแปรรูปมันสำปะหลังตามความต้องการใน
ตลาดส่งออก ในปี พ.ศ. 2563 พื้นที่เพาะปลูกมันสำปะหลังในประเทศมีขนาดประมาณ 9.4 ล้านไร่ ให้ผลผลิต
มันสำปะหลังประมาณ 29.0 ล้านตัน (รูปท่ี 1) จากความพร้อมด้านแหล่งผลิตวัตถุดิบมันสำปะหลัง ทำให้
ประเทศไทยเป็นผู้ส่งออกผลิตภัณฑ์มันสำปะหลังรายใหญ่ที่สุดของโลก แต่ทว่าการเพ่ิมผลผลิตโดยรวมของ
ประเทศมาจากการขยายพ้ืนท่ีปลูกเพิ่มมากข้ึน การพัฒนาพันธุ์มันสำปะหลังให้มีผลผลิตหัวสดต่อไร่สูงข้ึนจึง
เป็นเป้าหมายหลักในการปรับปรุงพันธุ์เพื่อเพ่ิมปริมาณและมูลค่าในมันสำปะหลัง และลดต้นทุนการผลิตให้
เกษตรกรมผี ลตอบแทนสงู ข้นึ

รูปที่ 1 กราฟแสดงผลผลติ มันสำปะหลัง (ล้านตัน) และพื้นที่เพาะปลกู มันสำปะหลัง (ลา้ นไร่) ในประเทศไทย
ตั้งแตป่ ี พ.ศ. 2554 - พ.ศ. 2563 (ท่ีมา: สำนกั งานเศรษฐกิจการเกษตร)

เทคโนโลยีชีวภาพเพ่อื การจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธม์ุ นั สำปะหลงั 72

ปัจจัยหลักในการปลูกมันสำปะหลังให้ได้ผลผลิตดี ได้แก่ 1) สภาพแวดล้อม เช่น การเตรียมดิน
การบำรงุ ดิน ปริมาณน้ำ และ 2) พันธุ์มันสำปะหลงั ทีใ่ ชป้ ลกู ซ่ึงเป็นปัจจัยท่ีขน้ึ อยู่กบั พนั ธุกรรม (genetic) ของ
พันธ์ุมันสำปะหลังน้ันๆ การพัฒนาพันธ์ุมันสำปะหลังในประเทศไทยที่ผ่านมา การปรับปรงุ พันธ์ุยังคงใช้วิธีการ
คัดเลือกพันธ์ุแบบดั้งเดิม (conventional breeding) ซึ่งมีข้อจำกัดทั้งในด้านระยะเวลาท่ียาวนานและการ
ลงทุนที่สูงมาก เนื่องจากมันสำปะหลังเป็นไม้ยืนต้นที่ต้องใช้ระยะเวลายาวนานประมาณ 8 – 10 ปี ดังนั้นการ
พัฒนาเคร่ืองหมายโมเลกุลเพ่ือช่วยในการคัดเลือก (MAS; marker assisted selection) ในมันสำปะหลัง
จึงช่วยนักปรับปรุงพันธ์ุในการคัดเลือกลักษณะท่ีต้องการได้ตั้งแต่ระยะต้นกล้าและช่วยร่นระยะเวลาในการ
ปรับปรุงพนั ธุ์มนั สำปะหลงั ได้ 3 – 4 ปี (Wolfe et al., 2017) เพื่อให้เกิดความมน่ั ใจในการคัดเลือกพันธท์ุ ่ีตรง
ตามความต้องการ ช่วยลดระยะเวลา พื้นท่ี และแรงงานในการปรับปรงุ พนั ธ์ุมันสำปะหลงั

ลักษณะผลผลติ มันสำปะหลัง (root yield)

มันสำปะหลัง (Manihot esculenta Crantz) จัดอยู่ในวงศ์ (family) Euphorbiaceae ซ่ึงเป็นวงศ์
เดียวกับ ยางพารา (Hevea brasiliensis), ละหุ่ง (Ricinus communis) และสบู่ดำ (Jatropha curcas)
เป็นพืชดิพลอยด์ (diploid) มีจำนวนโครโมโซมเท่ากับ 2n = 36 (Raji et al., 2009; Sakurai et al., 2013)
เป็นไม้ยนื ต้น ทม่ี ีดอกตัวผูแ้ ละดอกตัวเมียอยู่ในตน้ เดียวกัน (Monoecious) และเป็นพชื ผสมข้าม มันสำปะหลัง
เป็นพืชอาหารที่ให้แป้ง หัวมันสำปะหลังประกอบไปด้วยแป้งมากถึง 70-90% ของน้ำหนักผลผลิตแห้ง
(Baguma, 2004) แป้งน้ันเป็นสารโพลีแซกคาไรด์ท่ีประกอบด้วยโมโนเมอร์ของกลูโคสท่ีเชื่อมต่อกันด้วยพันธะ
ไกลโคไซด์ (glycosidic bond) สูตรเคมีพื้นฐานของโมเลกุลแป้งคือ (C6H10O5)n โครงสร้างของแป้งมี
องค์ประกอบหลัก 2 รูปแบบ ได้แก่ อะไมโลส (amylose) พันธะ α-1, 4 ท่ีมีโครงสร้างเป็นเส้นตรง และ
อะไมโลเพกติน (amylopectin) พันธะ α-1, 4 และ α-1, 6 ท่ีมีรูปร่างแตกเป็นกิ่ง (Martin and Smith, 1995;
Smith, 2001) (รปู ท่ี 2)

รูปท่ี 2 องคป์ ระกอบของแป้งมนั สำปะหลัง 73

เทคโนโลยีชวี ภาพเพอื่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลอื กพันธมุ์ นั สำปะหลัง

การสะสมแป้งในหัวมันสำปะหลังเกิดข้ึนที่บริเวณในไซโตพลาสซึมของเซลล์ราก การศึกษาในพืชท่ีเป็น
โมเดลอย่าง Arabidopsis และพืชท่ีผลิตแป้ง เช่น มันฝร่ัง พบว่ากระบวนการสังเคราะห์แป้งเริ่มจาก ในเซลล์
ใบท่ีซ่ึงเกิดวัฏจักรเคลวิน (Calvin cycle) โดยการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2 fixation) ในกระบวนการ
สังเคราะห์แสง (photosynthesis) ต่อด้วยในท่อลำเลียงอาหาร (phloem) เกิดการขนส่งน้ำตาลซูโครส
(sucrose transport) ซึ่งเป็นสารต้ังต้นในกระบวนการสังเคราะห์แป้งไปไว้ท่ีราก และในเซลล์รากที่เกิดการ
สร้างและเกบ็ สะสมแปง้ อย่างถาวร (Saithong, 2012) (รูปที่ 3)

รปู ท่ื 3 โมเดลจำลองกระบวนการสังเคราะห์แป้ง โดยแบ่งออกเป็น 3 ส่วน ได้แก่ เซลล์ใบ, ท่อลำเลียงอาหาร
และเซลล์ราก ในแต่ละส่วนแสดงวิถีปฏิกิริยาต่างๆ ที่เช่ือมต่อกันในกระบวนการสังเคราะห์แป้ง
(Saithong, 2012)

การพัฒนาเคร่ืองหมายโมเลกลุ จากยีนทีเ่ ก่ียวข้องกับลักษณะผลผลิตมันสำปะหลงั

ผลผลิตมันสำปะหลังเป็นลักษณะปริมาณ (quantitative trait) เป็นลักษณะที่ยนี หลายยีนควบคุมการ
แสดงออก และมีอทิ ธิพลทางส่ิงแวดล้อมมาเกี่ยวข้อง (Sraphet et al., 2017) ลักษณะน้ีจึงขึ้นอยู่กับพันธุ์และ
สภาพแวดล้อมท่ีปลูก จากการศึกษาการแสดงออกของยีนในมันสำปะหลัง พบว่าการสะสมของแป้งที่สูงขึ้น
เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยนี ในกระบวนการสังเคราะห์แป้งและการย่อยสลายแป้งภายในหัวมันสำปะหลัง
(Li et al., 2016) กระบวนการสงั เคราะห์แป้งในหัวมันสำปะหลังมี 3 ข้ันตอนหลัก ได้แก่ 1) การขนส่ง glucose-
6-phosphate (G6P) เข้าไปในอะไมโลพลาสต์ (amyloplast) 2) การสังเคราะห์ ADP-glucose (ADPG) จาก G1P
และ 3) การสังเคราะหแ์ ปง้ จาก ADPG (รูปท่ี 4) ยีนในกระบวนการสังเคราะห์แป้งและ expressed sequence
tags (EST) ของมันสำปะหลัง จำนวน 14 ยีน จากฐานข้อมูล GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
แสดงในตารางท่ี 1

เทคโนโลยชี ีวภาพเพ่ือการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพันธมุ์ นั สำปะหลงั 74

รูปท่ี 4 แสดงกระบวนการสังเคราะห์แป้งในมันสำปะหลัง (Tappiban et al., 2019) และยีนในกระบวนการ
สังเคราะห์แปง้ ในมันสำปะหลัง (ตวั อักษรเขม้ )

ตารางท่ี 1 ยีนในกระบวนการสงั เคราะห์แปง้ ของมันสำปะหลัง GenBank Full length
accession no. (bp)
No. Starch biosynthesis pathway genes DQ443534.1 2,775
1 sucrose synthase (SuSy) XM_021759711.1 2,190
2 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase (UGPase) XM_021743444.1 2242
3 cytosolic phosphoglucomutase (cPGM) KP009998.1 1,295
4 fructokinase1 (FRK) KP009999.1 1,182
KP010000.1 1,133
5 glucose-6-phosphate isomerase (cPGI) KP010001.1 1,046
6 hexokinase1 (HXK) KR338981.1 997
KP010002.1 1,222
XM_021745471.1 1,535
XM_021745472.1 1,275
KJ417433.1 1,546
KJ417434.1 1,767
KJ417435.1 1,702
KJ417436.1 1,537
KJ417437.1 1,567

เทคโนโลยีชวี ภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลอื กพันธม์ุ นั สำปะหลงั 75

No. Starch biosynthesis pathway genes GenBank Full length
7 adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase) accession no. (bp)
KU243122.1 1,618
8 plastidial phosphoglucomutase (pPGM) KU243124.1 1,578
XM_021737252.1 2,305
9 granule-bound starch synthase (GBSS) XM_021761283.1 2,266
JF708949.1 3,366
10 starch synthase (SS) JF708948.1 3,477
11 starch branching enzyme (SBE) XM_021741332.1 4,005
12 debranching enzyme (DBE) X77012.1 2,843
XM_021750994.1 1,879
13 glucan, water dikinase (GWD) XM_021750995.1 1,479
JN618458.1 4,728
14 sucrose transporters (SUT) JN618459.1 3,687
DQ138373.1 2,431
DQ138371.1 2,007

เคร่ืองหมายโมเลกุลเป็นเทคโนโลยีท่ีสามารถใช้ในการศึกษาพันธุศาสตร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ มีทั้ง
เคร่ืองหมายชนิดที่ไม่ทราบหน้าท่ี (anonymous marker) และเคร่ืองหมายชนิดที่เป็นยีนท่ีทราบหน้าที่ในการ
ทำงาน (functional marker) ซึ่งเคร่ืองหมายชนิดหลังน้ีมีประโยชน์อย่างมากทั้งในด้านการศึกษาพันธุศาสตร์
และการประยุกต์ใช้เพื่อการคัดเลือกในการปรับปรุงพันธุ์พืช (marker assisted selection) (Keyser et al., 2008)
ยีนประกอบด้วยบริเวณ อินทรอน (intron) และเอ็กซอน (exon) อินทรอนคือส่วนที่ไม่ได้แปลรหัสไปเป็น
โปรตีน (noncoding sequence) ในยีน เม่ือเทียบกับบริเวณเอ็กซอนแล้ว อินทรอนจะมีความหลากหลาย
มากกว่าเพราะในการคัดเลือกโดยธรรมชาติ ในบริเวณท่ีเป็นอินทรอนจะมีความอนุรักษ์น้อยกว่าบริเวณที่
เป็นเอ็กซอน เครื่องหมาย Intron length polymorphism (ILP) เป็นเคร่ืองหมายยีนท่ีพัฒนาได้ไม่ยุ่งยาก
และสามารถพัฒนาได้จากยีนเป้าหมายโดยตรงจากข้อมูล expressed sequence tags (EST) ในฐานข้อมูล
สาธารณะ ท้ังจากพืชที่ทำการวิจัยโดยตรงและจากพืชที่มีวิวัฒนาการใกล้เคียงกัน เครื่องหมาย ILP ใช้
ตรวจสอบความแตกต่างของความยาวอินทรอนที่เกิดจากการเพ่ิมเติมหรือขาดหายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วย
ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (Polymerase Chain Reaction, PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ท่ีจำเพาะกับบริเวณเอ็กซอน
ท่ีคร่อมส่วนท่ีคาดว่าเป็นอินทรอน ซึ่งตำแหน่งของอินทรอนสามารถทำนายได้โดยการเปรียบเทียบระหว่าง
ลำดบั เบส cDNA หรอื ESTs กบั ลำดับเบสจโี นม (Yang et al., 2007) (รปู ที่ 5) ดังนัน้ จึงสามารถระบตุ ำแหน่ง
ทเ่ี ป็นอินทรอนไดใ้ นส่ิงชวี ิตหลายชนิด เคร่ืองหมาย ILP เป็นเคร่ืองหมายชนิดข่มร่วม (codominant) ซ่ึงสามารถ
แยกความแตกต่างของจีโนไทป์แบบโฮโมไซกัส (homozygous) และ เฮทเทอโรไซกัส (heterozygous) ได้
อย่างชัดเจน (รปู ที่ 6) ดงั นั้นจึงสามารถพัฒนาเป็นเคร่ืองหมายเพ่ือช่วยในการคัดเลือกลักษณะในการปรับปรุง
พนั ธพ์ุ ืชได้เป็นอย่างดี

เทคโนโลยชี วี ภาพเพือ่ การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพนั ธมุ์ นั สำปะหลงั 76

รปู ที่ 5 การออกแบบไพรเมอรเ์ พื่อพัฒนาเครื่องหมาย Intron Length Polymorphism (ILP) ในมันสำปะหลัง

รูปท่ี 6 ตัวอยา่ งแถบดีเอน็ เอของเครือ่ งหมาย ILP ในตัวอย่างมนั สำปะหลัง 10 พันธ์ุ ท่ีพฒั นาจากยนี UGPase
ในกระบวนการสังเคราะห์แป้ง A) ผลการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอใน 2% agarose gel B) ผลการตรวจสอบ
แถบดเี อ็นเออย่างละเอยี ดด้วยเคร่อื งแยกสารพนั ธกุ รรมอัตโนมตั ิ (QIAxcel Advanced System)

เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อการจำแนก ตรวจสอบ และคดั เลือกพนั ธม์ุ นั สำปะหลัง 77

การใช้มันสำปะหลังพันธ์ุดีให้น้ำหนักผลผลิตสงู ถือว่าเป็นเทคโนโลยีที่สะดวก และงา่ ยสำหรับเกษตรกรใน
การเพ่ิมผลผลิตหรอื ปรับปรุงคุณภาพของมันสำปะหลัง ประกอบกับในปัจจุบันปรมิ าณความต้องการมันสำปะหลัง
เพ่ือใช้ภายในประเทศสูงมากขึ้น ดังนั้นการคัดเลือกพันธ์ุจากลักษณะภายนอกที่ปรากฏหรือลักษณะฟีโนไทป์ท่ี
มกั จะแปรผันไปตามสภาพแวดล้อมจึงไม่เพียงพอต่อการนำมาใช้ในการจำแนกและระบุสายพันธใ์ุ ห้ถูกต้องและ
แม่นยำ การนำเทคโนโลยีการใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาบ่งช้ีความแตกต่างหรือความหลากหลาย (genetic
diversity) ของมันสำปะหลัง ไม่ว่าจะเป็นลักษณะทางปริมาณ (quantitative trait) หรือลักษณะทางคุณภาพ
(qualitative trait) นับว่าเป็นเคร่ืองมือที่มีประสิทธิภาพในการแยกความแตกต่าง สามารถนำมาใช้ในการ
ตรวจสอบและคัดเลือกได้ในทุกช่วงการเจริญเติบโตของมันสำปะหลัง เนื่องจากดีเอ็นเอจะไม่เปลี่ยนแปลงไม่ว่า
จะทำการวิเคราะห์ในระยะใดของการเจริญเติบโตหรือใช้เน้ือเยื่อพืชจากส่วนใดก็ตาม นักปรับปรุงพันธุ์
จึงสามารถทำการคัดเลือกได้ตั้งแต่ต้นกล้าขนาดเล็ก ซ่ึงจะช่วยย่นระยะเวลาการคัดเลือกลง ประหยัดเวลา
ลดแรงงาน ลดต้นทุน และพ้ืนทใ่ี นการเพาะปลกู ได้

เอกสารอา้ งองิ

Baguma, Y. (2 0 0 4 ). Regulation of Starch Synthesis in Cassava. (Doctoral Thesis ), Swedish
University, Uppsala, Sweden.

Keyser, E. D., Riek, J. D., and Bockstaele, E. V. (2008). Discovery of species-wide EST-derived
markers in Rhododendron by intron-flanking primer design. Molecular Breeding,
23(1), 171-178. doi: 10.1007/s11032-008-9212-4

Li, Y. Z., Zhao, J. Y., Wu, S. M., Fan, X. W., Luo, X. L., and Chen, B. S. (2016). Characters related
to higher starch accumulation in cassava storage roots. Sci Rep, 6 , 1 9 8 2 3 . doi:
10.1038/srep19823

Martin, C., and Smith, A. (1995). Starch biosynthesis. Plant Cell, 7, 971-985.
Saithong, T. (2012). A Formal Path Inference of Starch Biosynthesis via Mathematical

Modelling of Metabolic Changes in Excess CO2. Journal of Computer Science &
Systems Biology, 05(02). doi: 10.4172/jcsb.1000087
Saithong, T. (2012). A Formal Path Inference of Starch Biosynthesis via Mathematical
Modelling of Metabolic Changes in Excess CO2. Journal of Computer Science &
Systems Biology, 05(02). doi: 10.4172/jcsb.1000087

เทคโนโลยชี ีวภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลือกพันธม์ุ นั สำปะหลงั 78

Sakurai, T., Mochida, K., Yoshida, T., Akiyama, K., Ishitani, M., Seki, M., and Shinozaki, K. (2013).
Genome-wide discovery and information resource development of DNA
polymorphisms in cassava. PLoS One, 8(9), e74056. doi: 10.1371/journal.pone.0074056

Smith, A. M. (2001). The biosynthesis of starch granules Biomacromolecules, 2, 335-341.
Sraphet, S., Boonchanawiwat, A., Thanyasiriwat, T., Thaikert, R., Whankaew, S., Smith, D.,

Boonseng, O., Lightfoot, D. A., and Triwitayakorn, K. (2017). Quantitative trait loci
underlying root yield and starch content in an F 1 derived cassava population
(Manihot esculenta Crantz). The Journal of Agricultural Science, 155(4), 569-581.
Tappiban, Piengtawan & Smith, Duncan & Triwitayakorn, K. & Bao, Jinsong. (2018). Recent
understanding of starch biosynthesis in cassava for quality improvement: A review.
Trends in Food Science & Technology. 83. 10.1016/j.tifs.2018.11.019.
Wolfe, M. D., Del Carpio, D. P., Alabi, O., Ezenwaka, L. C., Ikeogu, U. N., Kayondo, I. S., Lozano,
R., Okeke, U. G., Ozimati, A. A., Williams, E., Egesi, C., Kawuki, R. S., Kulakow, P., Rabbi,
I. Y., and Jannink, J. L. (2017). Prospects for Genomic Selection in Cassava Breeding.
Plant Genome, 10(3). doi: 10.3835/plantgenome2017.03.0015
Yang, L., Jin, G., Zhao, X., Zheng, Y., Xu, Z., and Wu, W. (2007). PIP: a database of potential
intron polymorphism markers. Bioinformatics, 23(16), 2174-2177. doi: 0.1093/
bioinformatics/btm296

เทคโนโลยีชีวภาพเพอ่ื การจำแนก ตรวจสอบ และคัดเลอื กพนั ธมุ์ นั สำปะหลัง 79