วิธีปฏิบัติงานที่ WI-MIH-31 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า ชื่อ –สกุล ตำแหน่ง ลายเซ็น ว-ด-ป จัดทำโดย น.ส. ช่อผกา ศิริพันธุ์ นักเทคนิคการแพทย์ 2 ตุลาคม 2566 ทบทวนโดย นางคติ แซ่ไหล ผู้จัดการคุณภาพ 2 ตุลาคม 2566 อนุมัติโดย น.ส. จันทนี นิติการุญ หัวหน้ากลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ 2 ตุลาคม 2566 เอกสาร ( X ) ควบคุม ( ) ไม่ควบคุม
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 2/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 บันทึกรายการแก้ไข แก้ไขครั้งที่ รายการแก้ไข วันที่แก้ไข 00 เริ่มใช้เอกสาร 2 ตุลาคม 2566
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 3/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) 1.0 วัตถุประสงค์ เพื่อใช้ในการวินิจฉัยภาวะโลหิตจางที่มีการแตกของเม็ดเลือดแดงในผู้ป่วยที่เป็นโรค PNH 2.0 ขอบข่าย ผู้ป่วยที่มีภาวะซีดจากเม็ดเลือดแดงแตกในเส้นเลือดขณะที่นอนหลับ และมีปัสสาวะสีเข้มเป็นสีโคคาโคลา 3.0 บทนิยามและคำย่อ 3.1 PNH = Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria เป็นโรคที่มีความผิดปกติของการสร้างเม็ดเลือดในไขกระดูกที่มีต้นกำเนิดมาจาก ความผิดปกติของเซลล์เพียงเซลล์เดียว ( clonal disorder ) ไม่ได้เกิดจากกรรมพันธุ์ แต่เกิดขึ้น ภายหลังคลอด( acquired ) ซึ่งเกิดจากการกลายพันธุ์แบบ somatic mutation ของยีนส์ PIG-A ( phosphatidylinositolglycan A class ในเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (stem cell ) ดังนั้นเม็ดเลือด ที่เจริญมาจากเซลล์ต้นกำเนิดที่ผิดปกติ จะขาดโปรทีน glycosylphosphatidylinositol anchor protein ( GPI-AP ) ที่มีโปรทีน CD55 ( decay accelerating factor ) และ CD59 ( membrane inhibitor of reactive lysis ) อยู่บนผนังของเม็ดเลือด โดยโปรทีน CD55 และ CD59 จะทำหน้าที่ควบคุมการทำงานของ complement การขาดโปรทีน 2 ชนิดนี้ไปจะทำให้เม็ด เลือดแดงของผู้ป่วยไวต่อ complement จึงแตกง่ายเมื่อไหลเวียนอยู่ในกระแสเลือด (IVH ) ทำให้ ตรวจพบฮีโมโกลบินออกมาในปัสสาวะ ( Hemoglobinuria ) 3.2 IVH = Intravascular hemolysis ภาวะที่มีเม็ดเลือดแดงแตกในเส้นเลือด 3.3 sugar water test คือการทดสอบเม็ดเลือดในน้ำยา isotonic sucrose ถ้าเป็นเม็ดเลือดผู้ป่วย PNH เมื่ออยู่ในน้ำยา จะเกิดการกระตุ้นของ complement ทำให้ผนังเม็ดเลือดแดงเกิดรูรั่ว น้ำตาลซึมเข้าไปได้เม็ดเลือดจึงแตก 4.0 เอกสารอ้างอิง 4.1 วนิดา (อัศวะมหาศักดา) อิฐรัตน์.โลหิตวิทยาทันยุค (modern Hematology)กรุงเทพมหานคร: เรือน แก้วการพิมพ์; 2545:หน้า 174 - 217 5.0 เอกสารที่เกี่ยวข้อง 5.1 SD-MIH-28 คู่มือการเตรียมน้ำยาทางห้องปฏิบัติการโลหิตวิทยา
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 4/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 5.2 SD-LAB-01 คู่มือการใช้บริการห้องปฏิบัติการทางเทคนิคการแพทย์ 5.3 WI-MIH-33 การทดสอบ urine hemosiderin 6.0 หลักการ เป็นการนำน้ำเหลืองปกติที่มี complement และมีหมู่เลือดตรงกับเม็ดเลือดแดงของผู้ป่วย มาทำให้เป็น กรด แล้วเติมลงไปในเม็ดเลือดแดง ในภาวะที่เป็นกรด complement จะถูกกระตุ้นให้มาจับกับผนังของเม็ด เลือดแดง เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยมีความไวมากกว่า จึงแตกง่ายกว่าคนปกติ แต่ถ้านำน้ำเหลืองไปอุ่นที่ 56 ๐ C นาน 30 นาทีก่อนทดสอบ จะไม่เห็นการแตกของเม็ดเลือดแดง เพราะ Complement ถูกทำลาย 7.0 เครื่องมือ เครื่องใช้ วัสดุอุปกรณ์ 7.1 หลอดแก้ว ขนาด 12 x 75 มม. 7.2 ขวดแก้วรูปชมพู่ ( Erlenmayer flask ) ขนาดบรรจุ 50 มล. จำนวน 2 ใบ 7.3 เม็ดแก้ว ( glass beads ) ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 4 มม. จำนวน 40 เม็ด 7.4 หลอดแก้ว ขนาด 16 x 100 มม. 7.5 pasteur pipette พร้อมลูกยางสำหรับดูด 7.6 ตะแกรงตั้งหลอดทดสอบ 7.7 อ่างน้ำอุ่น ( waterbath ) 7.8 พาราฟิล์ม 7.9 นาฬิกาจับเวลา 7.10 0.2 N HCl 7.11 0.85 % NSS 7.12 เลือดจากผู้ป่วยที่ทราบหมู่เลือดแล้ว 7.13 เลือดจากคนปกติที่มีหมู่เลือดเดียวกับผู้ป่วย 8.0 ขั้นตอนการดำเนินงาน 8.1 การเตรียม defibrinated blood จากเลือดผู้ป่วย นำเลือดที่เจาะจากเส้นเลือดดำจำนวน 20 มล. มาใส่ในขวดแก้วรูปชมพู่ขนาด 50 มล.ที่มีเม็ดแก้วบรรจุอยู่ 20 เม็ด เขย่าขวดแก้วให้วนไปทางซ้ายหรือขวาก็ได้ แต่ให้วนไปทางเดียวกันตลอดเวลาที่เขย่า อย่าให้แรงจนเกินไปเพราะอาจทำให้เม็ดเลือดแดงแตกได้ เขย่าไปจนไฟบรินในเลือดแยกออกมาจับกับเม็ดแก้วหมด โดยสังเกตจากที่ไม่ได้ยินเสียงเม็ดแก้ว กระทบกันแล้ว 8.2 การเตรียม defibrinated blood จากเลือดคนปกติ ให้ทำเช่นเดียวกับเลือดผู้ป่วย
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 5/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 8.3 นำเลือดที่เตรียมได้จากผู้ป่วยไปปั่นแยกซีรั่มและเม็ดเลือด ที่ความเร็ว 2,000 รอบนาน 5 นาที จากนั้นแยกซีรั่มและเม็ดเลือดไว้อย่างละหลอด 8.4 ปั่นแยกซีรั่มและเม็ดเลือดของคนปกติเช่นเดียวกับของผู้ป่วย แล้วนำซีรั่มของคนปกติจำนวน 0.5 มล. ใส่หลอดทดลองขนาด 12 x 75 ม.ม. ปิดพาราฟิล์มให้เรียบร้อยแล้วนำไปอุ่นที่ 56 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที 8.5 เม็ดเลือดที่แยกได้ทั้งของผู้ป่วยและของคนปกติให้นำมาทำเป็น 50 % cell suspension โดยวิธีการดังนี้ นำเม็ดเลือดมาล้างเซลล์ด้วยน้ำเกลือ 0.85 NSS 3 ครั้ง (ใช้ความเร็ว 2,000 รอบ/นาที นาน 2 นาที ) ต่อจากนั้นให้ทำเป็น 50 % cell suspension โดยใช้เม็ดเลือด : NSS ( 1:1 ) 8.6 เตรียมหลอดทดลอง ขนาด 12 x 75 มม. ใส่สารต่างๆดังตาราง Tube no. 50% Rbc suspension 0.05 ml Serum 0.5 ml 0.2 N HCl 0.05 ml Hemolysis 1 ผู้ป่วย ผู้ป่วย - - 2 ผู้ป่วย ผู้ป่วย + + 3 ผู้ป่วย คนปกติ* + - 4 ผู้ป่วย คนปกติ - - 5 ผู้ป่วย คนปกติ + + 6 คนปกติ ผู้ป่วย - - 7 คนปกติ ผู้ป่วย + - * serum ที่นำไป อุ่นที่ 56 ๐ C นาน 30 นาทีก่อนทดสอบ 8.7 ปิดพาราฟิล์มทุกหลอด แล้วนำไปแช่ในอ่างน้ำอุ่น 37 ๐ C นาน 1 ชั่วโมง เมื่อครบเวลานำมาปั่น ด้วยความเร็ว 2,000 รอบ/นาที นาน 2 นาที และสังเกต Hemolysis ที่เกิดขึ้นในแต่ละหลอด 9.0 การอ่านผลและรายงานผล 9.1 การรายงานผล Positive : มี Hemolysis ในหลอดที่ 2 และ หลอดที่ 5 Negative : ไม่เกิด Hemolysis ในหลอดที่ 2 และ หลอดที่ 5 9.2 ค่าปกติ Negative
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 6/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 9.3 การแปลผล นอกจาก Ham test positive แล้ว การวินิจฉัยผู้ป่วย PNH จะพบลักษณะดังนี้ 1. มีจำนวนเม็ดเลือดต่ำทั้ง 3 สาย 2. ฮีโมโกลบินอาจต่ำกว่า 6 กรัม/ดล. หรือมีระดับปกติ 3. Reticulocyte เพิ่มขึ้นแต่ไม่มากเท่าที่ควรเมื่อเทียบกับการแตกของเม็ดเลือดแดง 4. เม็ดเลือดแดงมีรูปร่างปกติ แต่ถ้ามีการขาดเหล็กร่วมด้วยจะเห็น hypochromic microcytic red cell อาจเห็น basic stippling และ nucleated red cell ได้ 5. ในไขกระดูกจะเห็น erythroid hyperplasia และ normal cellularity แต่อาจจะเปลี่ยนเป็น aplasia หรือ hypoplasia ได้ในระยะท้ายของโรค 6. Hemosiderin test positive 7. sugar water test positive 10.0 การควบคุมคุณภาพ 10.1 น้ำยาที่ใช้ในการทดสอบควรเตรียมใหม่ทุกเดือน 10.2 เลือดที่เป็น control ควรเป็นเลือดกรุ๊ปเดียวกับผู้ป่วยเพื่อป้องกันการเกิด hemolysis ซึ่งทำให้อ่านผลผิดได้ 11.0 การบันทึกผล 11.1 บันทึกลงในระบบสารสนเทศ LIS (Laboratory Information System) และระบบ HIS (Hospital Information System) ของโรงพยาบาลพระปกเกล้า 11.2 กรณีระบบคอมพิวเตอร์ของโรงพยาบาลขัดข้องให้บันทึกผลลงใน F-MIH-18 แบบบันทึกผล- การตรวจพิเศษ 12.0 รายละเอียดอื่นๆ 12.1 การทดสอบนี้ไม่จำเพาะสำหรับ PNH เลยทีเดียว ในผู้ป่วย Hemolytic anemia ถ้ามี spherocyte มากอาจให้ผลบวกด้วย และในผู้ป่วย PNH บางครั้งอาจให้ผลลบได้ 12.2 ปัจจุบันการวินิจฉัย PNH สามารถใช้เครื่อง Flow cytometry วิเคราะห์ทั้ง หรือ CD55 และ CD59 บนผนังเม็ดเลือดแดง หรือวิเคราะห์ CD55 บนผนังของ granulocytes และ lymphocytes โดยใช้ anti-CD59 และ anti-CD55 12.3 การแตกของเม็ดเลือดแดงในเส้นเลือด ( IVH ) ถ้าในเลือดมีระดับ Free Hemoglobin < 30-40 gram/100 ml. Hemoglobin จะถูกเปลี่ยนเป็น hemosiderin ที่ไต ทำให้เกิด hemosiderinuria แต่ว่าถ้ามีระดับ Free Hemoglobin > 30-40 gram/100 ml. จะตรวจพบ Hemoglobinuria ด้วย
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 7/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 13.0 ภาคผนวก 13.1 ภาคผนวก 1 F-MIH-18 แบบบันทึกผลการตรวจพิเศษ (Special Test) 13.2 ภาคผนวก2 การเตรียมน้ำยา 0.2 N HCl
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 8/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 ภาคผนวก1 F-MIH-18 แบบบันทึกผลการตรวจพิเศษ Date No Name Ward Ct SpLE Rea Ct Heinz Sp Rea Ct SpHam Rea t CHemosiderin p S a e R a e R Othersผู้วิเคราะห์
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงานที่ : WI – MIH –31 หน้า 9/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง การทดสอบ Ham test ( Acidified serum lysis test ) วันที่ประกาศใช้ 2 ตุลาคม 2566 ภาคผนวก2 การเตรียมน้ำยา 1. การเตรียมน้ำยา 0.2 N HCl เจือจางกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น ( 37 % spgr 1.19) 16.6 มิลลิลิตรในน้ำกลั่นจนครบ 1,000 มิลลิลิตร