วิธีปฏิบัติงานที่ WI-MIH-28 เรื่อง การนับจ านวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน (Reticulocyte count) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า ชื่อ –สกุล ต าแหน่ง ลายเซ็น ว-ด-ป จัดท ำโดย น.ส. ช่อผกำ ศิริพันธุ์ นักเทคนิคกำรแพทย์ 2 ตุลำคม 2566 ทบทวนโดย นำงคติ แซ่ไหล ผู้จัดกำรคุณภำพ 2 ตุลำคม 2566 อนุมัติโดย น.ส. จันทนี นิติกำรุญ หัวหน้ำกลุ่มงำนเทคนิคกำรแพทย์ 2 ตุลำคม 2566 ส ำเนำส ำleฉ บับ เอกสำร ( X ) ควบคุม ( ) ไม่ควบคุม
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 2/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 บันทึกรายการแก้ไข แก้ไขครั้งที่ รำยกำรแก้ไข วันที่แก้ไข 00 เริ่มใช้เอกสำร 2 ตุลำคม 2566
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 3/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 การนับจ านวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte ) 1.0 วัตถุประสงค์ เพื่อใช้เป็นคู่มือในกำรวัดสมรรถภำพของไขกระดูกในกำรสร้ำงเม็ดเลือดแดง ( effective erythropoietin activity ) 2.0 ขอบข่าย ส ำหรับเลือดปลำยนิ้วหรือ EDTA blood ที่สดใหม่ ไม่ควรใช้เลือดที่เก็บไว้นำนเกิน 12 ชั่วโมง 3.0 บทนิยามและค าย่อ 3.1 anemia = ภำวะที่มีปริมำณเม็ดเลือดแดงน้อยกว่ำปกติ ท ำให้ควำมสำมำรถในกำรขนส่งออกซิเจน น้อยลง ปริมำณเม็ดเลือดแดงวัดได้จำกระดับฮีโมโกลบิน หรือ จำกค่ำ Hematocrit 3.2 Reticulocyte = เม็ดเลือดแดงตัวอ่อนที่ไม่มีนิวเคลียส แต่ยังคงมีสำร ribonucleoprotein อยู่ภำยใน เซลล์ มีคุณสมบัติในกำรติดสีชนิดพิเศษที่เรียกว่ำ supravital stain ท ำให้ปรำกฏเป็นแกรนูลชนำดเล็ก หรือเส้นใยร่ำงแห ( reticulum ) ติดสีน้ ำเงินเข้มโดยขึ้นอยู่กับอำยุของเซลล์ 3.3 EDTA = Ethylene Diamine Tetra acetic Acid 3.4 corrected reticulocyte count หมำยถึงจ ำนวน reticulocyte ที่ได้นับแก้ไขแล้ว ในกรณีที่มีภำวะ โลหิตจำง และ/หรือมีระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือด ( reticulocyte maturation time )ยำวนำนกว่ำปกติ อันเป็นผลจำก reticulocyte อำยุน้อย ( shift reticulocyte หรือ polychromasia ถูกปล่อยออกมำในกระแสโลหิต ก่อนก ำหนดเวลำ ค่ำที่ได้จะใช้ เป็นดัชนีที่แสดงถึงสมรรถภำพของไขกระดูกได้อย่ำงแท้จริง สำมำรถค ำนวณได้โดยน ำค่ำจ ำนวนร้อยละ ของ reticulocyte ไปสัมพันธ์กับค่ำฮีโมโกลบิน ฮีมำโตคริท จ ำนวนเม็ดเลือดแดงหรือระยะเวลำแก่ตัว ของ reticulocyte reticulocyte index หมำยถึงจ ำนวน reticulocyte ที่ได้นับแก้ไขแล้วในรำยที่ผู้ป่วยมีภำวะโลหิตจำง ค ำนวณได้โดยใช้สูตร 3.5 Reticulocyte index ( %) = ( จ ำนวนร้อยละของ reticulocyte x ฮีมำโตคริท ผู้ป่วย)/ ฮีมำโตคริท คนปกติ ( 45 % ) 3.6 Reticulocyte production index หมำยถึงจ ำนวน reticulocyte ที่ได้นับแก้ไขแล้วในรำยที่ผู้ป่วยมีทั้ง ภำวะโลหิตจำง และมีระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือดนำนกว่ำปกติ ค ำนวณได้โดยใช้ สูตร RPI = reticulocyte index / ระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือด (วัน)
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 4/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 4.0 เอกสารอ้างอิง 4.1 วนิดำ (อัศวะมหำศักดำ) อิฐรัตน์.โลหิตวิทยำทันยุค (modern Hematology) กรุงเทพมหำนคร: เรือน แก้วกำรพิมพ์; 2545: หน้ำ 480. 4.2 ศิริพร คุปตเมธี: บทที่ 12 กำรนับจ ำนวน reticulocyte:สุนำรี องค์เจริญใจ (ผู้รวบรวม ).เทคนิคพื้นฐำน ทางโลหิตวิทยา (Basic Hematological Techniques ) : ภำควิชำจุลทรรศนศำสตร์คลินิก คณะ เทคนิคกำรแพทย์ มหำวิทยำลัยมหิดล; 2546: หน้ำ89-95. 4.3 ยิ่งยง ชินธรรมมิตร์และธีระ ฤชุตระกูล. แนวทำงกำรวินิจฉัยภำวะโลหิตจำง: CME Articles.คณะ แพทยศำสตร์ศิริรำชพยำบำล. Retrieved from http://www.simahidol.ac.th/education/Sirirajcme/p3.hml 5.0 เอกสารที่เกี่ยวข้อง 5.1 SD-HEM-28 คู่มือกำรเตรียมน้ ำยำทำงห้องปฏิบัติกำรโลหิตวิทยำ 5.2 SD-LAB-01 คู่มือกำรใช้บริกำรห้องปฏิบัติกำรเทคนิคกำรแพทย์ 6.0 หลักการ สำร ribonucleoprotein ใน reticulocyte จะถูกย้อมด้วย supravital stain ( ได้แก่สี brilliant cresyl blue หรือ new methylene blue ) ในขณะที่เซลล์ยังมีชีวิตอยู่ ท ำให้ปรำกฏเป็นแกรนูลชนำดเล็ก หรือเส้นใยร่ำงแห ( reticulum ) ติดสีน้ ำเงินเข้มกระจำยอยู่ภำยในเซลล์ นับจ ำนวน reticulocyte ต่อเม็ด เลือดแดงทั้งหมด 1,000 เซลล์เป็นอย่ำงน้อย และค ำนวณเป็นจ ำนวนร้อยละ 7.0 เครื่องมือ เครื่องใช้ วัสดุอุปกรณ์ 7.1 สีที่ใช้ย้อม 1% (w/v) new methylene blue 7.2 สไลด์แก้ว 1 x 3 นิ้ว 7.3 อ่ำงน้ ำควบคุมอุณหภูมิ ( water bath 37๐C ) 7.4 หลอดทดลองแก้ว ขนำด 12 x 75 mm. 7.5 capillary tube ( blue ) 7.6 ตัวไถสไลด์ ( spreader ) 7.7 กล้องจุลทรรศน์
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 5/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 8.0 ขั้นตอนการด าเนินงาน 8.1 ใส่สีย้อม 100 ไมโครลิตรลงในหลอดแก้ว 8.2 เติมเลือดลงไป 100 ไมโครลิตร แล้วผสมให้เข้ำกัน 8.3 น ำหลอดทดลองไปตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 30 นำทีหรือ น ำไปแช่ในอ่ำงน้ ำควบคุมอุณหภูมิ37๐C นำน 20 นำที 8.4 น ำส่วนผสมของสีและเลือดมำท ำสเมียร์เลือดบำง ตำกทิ้งไว้ให้แห้ง 8.5 ในกรณีที่ต้องกำรเก็บสเมียร์เลือดไว้นำน ควรย้อมทับด้วยสีไรท์ 8.6 ตรวจนับจ ำนวน reticulocyte ด้วยกล้องจุลทรรศน์ก ำลังขยำย 100x 9.0 การอ่านผลและรายงานผล 9.1 กำรตรวจนับ ให้ท ำกำรนับจ ำนวน reticulocyte ต่อเม็ดเลือดแดงทั้งหมด 1,000 เซลล์เป็นอย่ำงน้อย และค ำนวณเป็นจ ำนวนร้อยละ 9.2 กำรรำยงำนผล 9.2.1 รายงานเป็นจ านวนร้อยละของจ านวนเม็ดเลือดแดงทั้งหมด ( เปอเซนต์ ) 9.2.2 รำยงำนเป็นค่ำสัมบูรณ์ในรูปของ absolute reticulocyte count absolute reticulocyte count = จ ำนวนร้อยละของ reticulocyte x Rbc count / 100 9.2.3 รำยงำนเป็น corrected reticulocyte count มี 2 แบบคือ 9.2.3.1 ดัชนีreticulocyte (reticulocyte index ) RI ( %) = ( จ ำนวนร้อยละของ reticulocyte x ฮีมำโตคริท ผู้ป่วย) / ฮีมำโตคริท คนปกติ (45%) 9.2.3.2 ดัชนีกำรผลิต reticulocyte (reticulocyte production index ) RPI = reticulocyte index / ระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือด (วัน) ตำรำงแสดงระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือด ฮีมำโตคริท ( % ) ระยะเวลำแก่ตัวของ reticulocyte ในกระแสเลือด(วัน ) 45 1.0 35 1.5 25 2.0 15 2.5
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 6/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 9.3 ค่ำปกติ ผู้ใหญ่ 0.2 - 2.0 % เด็กแรกเกิด 2.0 - 6.0 % cord blood ( อำยุครรภ์เฉลี่ย 39.2 สัปดำห์ ) 3.11 ± 0.75 % Foetus อำยุ 3 เดือน 90 % Foetus อำยุ 6 เดือน 15-30 % absolute reticulocyte count 25 – 75 x 109 เซลล์/ ลิตร reticulocyte index 0.5 - 2.0 % reticulocyte production index 0.5 - 2.0 9.4 กำรแปลผล 9.4.1 ภำวะที่มีจ ำนวน reticulocyteในกระแสโลหิตสูงกว่ำปกติ เรียกว่ำ Reticulocytosis ซึ่งพบในภำวะและโรคต่อไปนี้ คือ 1. Blood loss หรือ hemorrhage 2. Hemolytic anemia ชนิดต่ำงๆ 3. ภำวะโลหิตจำงจำกกำรขำดเหล็ก และ megaloblastic anemia ที่มีกำรตอบสนองจำกกำรรักษำ 4. Bone marrow infiltration ( myelophthisis ) เช่น leukemia ชนิดต่ำงๆ myelofibrosis, tuberculosis และมะเร็งแพร่กระจำยเข้ำไขกระดูก เป็นต้น 9.4.2 ภำวะที่มีจ ำนวนreticulocyteในกระแสโลหิตต่ ำกว่ำปกติ เรียกว่ำ Reticulocytopenia ซึ่งพบใน ภำวะและโรคต่อไปนี้ คือ 1. Aplastic anemia 2. Pernicious anemia 3. Decreased erythropoiesis 10.0 การควบคุมคุณภาพ 10.1 บุคลำกรต้องผ่ำนกำรอบรมด้ำนกำรตรวจนับ reticulocyte ทำงห้องปฏิบัติกำร 10.2 Normal control เตรียมโดยใช้เลือดคนปกติท ำกำรทดสอบไปด้วยในแต่ละวันที่เปิดให้บริกำร
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 7/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 11.0 การบันทึกผล 11.1 บันทึกลงในระบบสำรสนเทศ LIS (Laboratory Information System) และระบบ HIS (Hospital Information System) ของโรงพยำบำลพระปกเกล้ำ 11.2 กรณีระบบคอมพ์ขัดข้องให้บันทึกผลลงใน F-MIH-21 แบบบันทึกผลกำรตรวจวิเครำะห์ กรณี LIS ใช้ งำนไม่ได้ (CBC/Parasite/Coagulation) 12.0 รายละเอียดอื่นๆ 12.1 กำรเตรียมตัวอย่ำงตรวจ สัดส่วนของเลือดและสีอำจ เปลี่ยนแปลงได้ เช่นในผู้ป่วยโลหิตจำงควรใช้ ปริมำณเลือดมำกกว่ำสี และในผู้ป่วยที่มีจ ำนวนเม็ดเลือดแดงสูงมำกๆควรใช้ปริมำณสีมำกกว่ำเลือด 12.2 ประโยชน์ของกำรนับ reticulocyte 12.2.1 ใช้เป็นกำรทดสอบกรอง (screening test ) ร่วมกับค่ำ parameter ทำงโลหิตวิทยำอื่น เพื่อจ ำแนก ชนิดภำวะโลหิตจำงตำมสำเหตุ เช่น ในผู้ป่วยภำวะชนิดเม็ดเลือดแดงแตกง่ำย (hemolytic anemia) จะมีจ ำนวน reticulocyte สูงกว่ำปกติ (มำกกว่ำ 5%) ในขณะที่โรคไขกระดูกฝ่อ (aplastic anemia) กลับมีจ ำนวน reticulocyte ต่ ำกว่ำปกติ 12.2.2 ช่วยประเมินและติดตำมผลกำรรักษำภำวะโลหิตจำงจำกำรขำดเหล็ก (iron deficiency anemia) และ megaloblastic anemia โดยถ้ำผู้ป่วยดังกล่ำวมีกำรตอบสนองต่อกำรรักษำจ ำนวน reticulocyte จะ ขึ้นสูงสุดประมำณวันที่ 8-10 ภำยหลังได้รับกำรรักษำ 12.2.3 ช่วยในกำรพยำกรณ์โรคไขกระดูกฝ่อ ผู้ป่วยที่มีจ ำนวน reticulocyte เท่ำกับ 0 แสดงถึงกำรพยำกรณ์ โรคที่เลวลง 12.2.4 ช่วยชี้บ่งว่ำกำรผลิตเม็ดเลือดแดงในไขกระดูกเพื่อตอบสนองต่อภำวะโลหิตจำงนั้นได้ด ำเนินไปอย่ำง ปกติหรือไม่ 12.3 ข้อผิดพลำดในกำรนับจ ำนวน reticulocyte โดยวิธี Manual 12.3.1 กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงน้อยเกินไป โดยเฉพำะเมื่อมีจ ำนวน reticulocyte ในเลือดต่ ำกว่ำปกติ 12.3.2 บริเวณที่ใช้นับมีกำรกระจำยตัวของเซลล์ไม่สม่ ำเสมอ 12.3.3 reticulocyte ติดสีไม่ชัดเจน เนื่องจำกใช้สัดส่วนของเลือดและสีไม่เหมำะสม 12.3.4 กำรดูสับสนกับตะกอนสี 13.0 ภาคผนวก 13.1 ภำคผนวก 1 F-MIH-21 แบบบันทึกผลกำรตรวจวิเครำะห์ กรณี LIS ใช้งำนไม่ได้ (CBC/Parasite/Coagulation) 13.2 ภำคผนวก 2 กำรเตรียมน้ ำยำและสีย้อม
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 8/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 ภาคผนวก 1 F-MIH-21 แบบบันทึกผลการตรวจวิเคราะห์ กรณี LIS ใช้งานไม่ได้ (CBC/Parasite/Coagulation)
กลุ่มงานเทคนิคการแพทย์ โรงพยาบาลพระปกเกล้า วิธีปฏิบัติงำนที่ : WI – MIH–28 หน้ำ 9/9 แก้ไขครั้งที่ 00 เรื่อง กำรนับจ ำนวนเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน ( Reticulocyte count ) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ วันที่ประกำศใช้ 2 ตุลำคม 2566 ภาคผนวก 2 การเตรียมน้ ายาและสีย้อม 1. สีย้อม 1% ( w/v ) New methylene blue ชั่ง New methylene blue 1 gram ผสมกับ citrate saline solution 100 มิลลิลิตร เขย่ำและกรอง สีก่อนใช้ 2. กำรเตรียม citrate saline solution 2.1 ใช้ Sodium citrate solution ( 30 g/L) 20 ml. 2.2 ผสมกับ Sodium saline solution ( 9 g/L) 80 ml