PANDUAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

TATA TERTIB PRAKTIKUM

Dalam praktikum mikrobiologi, saudara bekerja dengan mikroorganisme, oleh karena itu
hendaknya berhati-hati karena mikroorganisme ini sangat kecil atau tidak kasat mata dan
tidak berwarna sehingga sukar dilihat atau diketahui keberadaannya. Walaupun bahan yang
disediakan umumnya tidak berbahaya bagi kesehatan namun tetap harus berhati-hati dengan
mikroorganisme. Laksanakan dengan tertib dan seksama semua petunjuk yang telah
diberikan oleh pembimbing, serta patuhilah semua tata tertib laboratorium sebagai berikut:
1. Letakkan tas dan benda-benda lain milik saudara yang tidak diperlukan pada tempat yang

telah disediakan. Jangan sekali-kali meletakkan barang-barang lain diatas meja
praktikum.
2. Dilarang melakukan aktivitas makan dan minum didalam laboratorium mikrobiologi.
3. Gunakanlah jas laboratorium selama praktikum berlangsung karena saudara akan bekerja
dengan bahan-bahan kimia dan mikroorganisme.
4. Lepaskanlah sepatu dan gunakanlah sandal khusus laboratorium saudara, gunakanlah
masker dan sarung tangan (hands glove steril) bila perlu.
5. Sebelum mulai bekerja pelajari dengan sungguh apa yang akan dilakukan. Buatlah skema
kerja yang baik sehingga saudara dapat bekerja dengan tepat, cepat dan teliti.
6. Kondisi steril penting dalam praktikum mikrobiologi, oleh karena itu ikutilah selalu cara
kerja secara tepat dan steril. Apabila hal ini diabaikan maka tidak menutup kemungkinan
saudara akan mengalami kegagalan
7. Jauhkan tangan saudara dari mulut, hidung, telinga selama bekerja di laboratorium
8. Kalau terjadi kesalahan atau kecelakaan segera lapor kepada asisten dan pembimbing
9. Setelah praktikum selesai, bersihkan semua alat-alat yang telah digunakan menurut
ketentuan laboratorium. Meja dibersihkan dengan menggunakan desinfektan atau alkohol
setelah selesai mengerjakan praktikum.
10. Sebelum meninggalkan laboratorium, matikan gas atau kompor pemanas, lampu, air dan
jangan lupa mencuci tangan dengan desinfektan.

PENGENALAN ALAT LABORATORIUM

1. Laminar air flow (LAF) Sumber: google.com
Alat yang berfungsi sebagai ruangan
untuk pengerjaan secara eseptis.
Prinsip peng-aseptisan suatu ruangan
berdasarkan aliran udara keluar dengan
kontaminasi udara dapat diminimalkan.

2. Mikroskop Sumber: google.com
Alat bantu yang digunakan untuk Sumber: google.com
melihat benda-benda atau jasad renik Sumber: google.com
yang berukuran mikron.

3. Autoklaf
Alat yang hampir mirip dengan panci
atau dandang, alat ini berfungsi untuk
sterilisasi alat dan bahan yang akan
digunakan untuk pekerjaan
mikrobiologi.

4. Kompor Listrik
Alat yang digunakan untuk
memanaskan media atau bahan lain
yang akan digunakan dalam praktek
mikrobiologi.

5. Magnetic Stirer
Alat yang berfungsi menghomogenkan
suatu larutan dengan pengadukan.

Sumber: google.com

6. Timbangan Analitik Sumber: google.com
Alat yang berfungsi untuk menimbang Sumber: google.com
bahan yang akan digunakan dalam
praktikum dengan tingkat ketelitian
yang tinggi.

7. Jarum Ose
Alat yang digunakan untuk
menginokulasi mikroba yang akan
dipindahkan ke medium lain dan untuk
mengambil media yang padat.

1.
8. Vortex

Alat yang berfungsi untuk
menghomogenkan suspensi sampel.

Sumber: google.com

9. Rak Tabung Reaksi
Alat yang berfungsi untuk meletakkan
tabung reaksi.

10. Tabung Reaksi Sumber: google.com
Alat ntuk meletakkan sampel atau Sumber: google.com
larutan.

11. Mikro pipet Sumber: google.com
Alat yang berfungsi untuk
memindahkan cairan yang bervolume
cukup kecil, biasanya kurang dari 1000
µl.

12. Pipet Tetes Sumber: google.com
Alat untuk mengambil larutan dalam Sumber: google.com
ukuran yang sedikit (kurang teliti Sumber: google.com
pengukurannya dalam bentuk tetes). Sumber: google.com
Ukuran pipet tets beragam, ada yang
berukuran kecil dan pendek, ada pula
yang berukuran besar dan panjang.

13. Pipet Berukuran atau Pipet Volume
Berupa pipa kurus dengan skala di
sepanjang dindingnya. Berguna untuk
mengukur dan memindahkan larutan
dengan volume tertentu secara tepat.

14. Inkubator
Alat yang berfungsi untuk
menumbuhkan mikroorganisme yang
ingin ditumbuhkan (untuk
menginkubasi).

15. Spatula
Berupa sendok panjang dengan ujung
atasnya datar, terbuat dari stainless steel
atau alumunium. Fungsi dari spatula
antara lain:
a. Untuk mengambil bahan kimia yang
berbentuk padatan
b. Dipakai untuk mengaduk larutan

16. Batang Penyebar (Bacterial Cell Sumber: google.com
Spreader)
Alat yang digunakan untuk
menyebarkan biakan bakteri yang
terdapat pada wadah pembiakan.

17. Bunsen
Alat yang berfungsi untuk sterilisasi
dengan pemanasan.

Sumber: google.com

18. Beaker Glass
Alat yang digunakan ntuk meletakkan
dan mengukur suatu larutan.

Sumber: google.com

19. Gelas Ukur
Sebagai alat ukur volume cairan yang
tidak memerlukan ketelitian yang
tinggi.

20. Erlenmeyer Sumber: google.com
Alat yang digunakan untuk meletakkan Sumber: google.com
atau mencampur suatu larutan atau Sumber: google.com
media cair.

21. Botol Cuci
Berupa botol tinggi bertutup yang
terbuat dari plastik. Berfungsi sebagai
tempat menyimpan aquades. Cara
menggunakannya dengan menekan
badan botol sampai airnya keluar.

22. Kaca Benda dan Kaca Penutup (Object Sumber: google.com
Glass dan Cover Glass)
Kaca benda berguna untuk meletakkan
objek pengamatan mikroskopik. Kaca
penutup berguna untuk menutup objek
pengamatan mikroskopis yang akan
diamati.

STERLISISASI
Perlakuan mikroba di laboratorium suatu persiapan yaitu sterilisasi alat dan media
tumbuh. Sterilasasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan alat atau benda dari semua
mikroba. Sterilisasi dibedakan menjadi 3 cara yaitu: secara mekanik, fisik dan kimiawi.
Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil
(0.22 µ atau 0.45 µ) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan
untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik. Sterilisasi
secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran.
1. Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh:
jarum inokulum, pinset, batang L.
b. Panas kering: sterilisasi menggunakan oven (170-180)°C selama 1,5-2 jam. Proses
sterilisasi panas kering terjadi melalui mekanisme konduksi panas. Panas akan
diabsorpsi
oleh permukaan luar alat yang disterilkan, lalu merambat ke bagian dalam permukaan
sampai akhirnya suhu untuk sterilisasi tercapai. Pada sterilisasi panas kering,
pembunuhan mikroba terjadi melalui mekanisme oksidasi sampai terjadi koagulasi
protein sel. Sterilisasi menggunakan cara ini kurang efektif dalam untuk membunuh
mikroba sehingga memerlukan suhu yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang.
Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca misal:
Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan Petri
c. Uap air panas bertekanan: sterilisasi menggunakan autoclave (121°C, tekanan 1,5-2
atm, kurang lebih 2 jam sampai suhu didalam autoclave turun). Pada saat melakukan
sterilisasi uap bertekanan, sebenarnya dari uap jenuh pada tekanan tertentu selama
waktu dan suhu tertentu pada suatu objek terjadi pelepasan energi uap yang
mengakibatkan denaturasi atau koagulasi protein sel mikroba sehingga melemahkan
aktivitas mikroba. Selain itu, sterilisasi menggunakan autoclave merupakan cara yang
paling baik karena uap air panas dengan tekanan tinggi menyebabkan penetrasi uap
air ke dalam selsel mikroba menjadi optimal sehingga langsung mematikan mikroba.
Sterilisasi ini digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca dan bahan/media misal:
Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan Petri, PDA, NA.

2. Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan LAF. disterilkan dengan cara
disinari lampu UV.

Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
Cara kerja sterilisasi alat:

1. Semua alat dari kaca yang akan digunakan dicuci menggunakan sabun dan dibilas
air mengalir sampai bersih selanjutnya dikeringkan.

2. Setelah kering, untuk cawan Petri dibungkus kertas sampul coklat, tabung reaksi dan
Erlenmeyer disumbat kapas/aluminium foil/tutup karet. Tahapan ini dilakukan
dengan tujuan mengurangi kontaminan yang masuk ke cawan Petri, tabung reaksi
dan Erlenmeyer.

3. Semua alat yang telah siap disterilkan menggunakan autoclave dan oven. Selain
sterilisasi alat dan media, pada prosedur kerja mikrobiologi dikenal teknik
aseptik yang bertujuan untuk mengurangi keberadaan mikroba kontaminan. Teknik
aseptic digunakan setiap akan melakukan pekerjaan yang berhubungan dengan
mikroba seperti menyemprot seluruh bagian dalam LAF menggunakan alkohol 70%,
memijarkan jarum Ose ketika akan digunakan di atas lampu Bunsen, memutar cawan
Petri saat dibuka dan mulut tabung reaksi saat dibuka sebelum atau sesudah
digunakan di dekat lampu Bunsen.

PEMBUATAN MEDIA
1. Fungsi Media

Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini
perlu disterilkan terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak
dikehendaki (kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik,
maka persyaratan yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah:
a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan

ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace
elemen serta zat pengatur tumbuh.
b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.
c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang
diperlukan.
2. Jenis media
a. Media berdasarkan konsistensi atau kepadatannya:
1) Medium cair (broth/liquid medium)

Yaitu medium yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient
Broth), LB (Lactose Broth). Medium cair akan memberi kesempatan kepada bakteri
untuk menyebar dan tercampur dengan seluruh nutrient, sehingga lebih cocok
untuk mengoptimalkan pertumbuhan mikroba. Medium cair dapat juga digunakan
untuk
mengetahui karakter suatu mikroba berdasarkan kebutuhan oksigen.
2) Medium setengah padat (semi solid medium)
Yaitu medium yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal,
tidak padat dan tidak begitu cair. Medium semi solid dibuat dengan tujuan agar
mikroba dapat menyebar ke seluruh media namun tidak mengalami pencampuran
sempurna jika dilakukan agitasi atau penggoyangan.
3) Medium padat (solid medium)
Medium semi solid dan solid menggunakan bahan pemadat (seperti amilum,
gelatin, selulosa dan agar-agar). Untuk medium padat/solid, dapat menggunakan
agar-agar dengan kadar 1,5 % - 1,8 % (15 g agar/l liter aquades). Fungsi medium
padat untuk memudahkan penghitungan koloni mikroba.

b. Media berdasarkan berdasarkan komposisi bahannya:
1) Media sintetik/media terdefinisi (synthetic media/defined media)
Adalah media yang seluruh komposisinya diketahui, contohnya adalah media yang
telah diproduksi oleh pabrik yang telah memiliki komposisi media yang telah rinci
dan jelas. Media sintetik digunakan dalam penelitian mengenai uji metabolisme
suatu mikroorganisme. Banyak jenis mikroorganisme kemoorganotrof heterotrof
dapat tumbuh pada media sintetik dengan glukosa sebagai sumber karbon dan
ammonium salt sebagai sumber nitrogen (Prescott ,2002).
2) Media kompleks (complex media)
Adalah media yang sebagian komposisinya tidak diketahui dengan pasti, contohnya
adalah media yang telah dibuat secara mandiri dengan bahan-bahan tertentu namun
pembuat tidak mengetahui pasti komposisi dari bahan-bahan tersebut secara pasti
dan rinci. Media ini dapat mengandung bahan yang tidak diketahui pasti
komposisinya seperti peptone, meat extract dan yeast extract. Contoh media
kompleks, adalah nutrient broth, tryptic soy broth dan MacConkey agar (Prescott,
2002).

c. Media berdasarkan berdasarkan tujuannya:
1) Media isolasi
Adalah media umum yang digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba menjadi
kultur murni. Media isolasi biasanya mengandung semua kebutuhan mikroba untuk
tumbuh dan tergantung tujuan isolasinya, misalnya Blood agar atau Chocolate agar,
NA, NB, PDA, TEA, PCA (Barrow and Feltham, 1993).
2) Media selektif (selective or inhibitory media)
Berfungsi untuk menumbuhkan mikroba target atau yang diinginkan dan menekan
pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan (background flora). Umumnya media
selektif menseleksi mikroba target berdasarkan kelompok, genus atau spesiesnya,
misalnya EMBA untuk seleksi E-coli, Baird parker untuk isolasi S. aureus; MRS
untuk bakteri asam laktat (Barrow and Feltham, 1993).
3) Media pengaya (enrichment media)
Media pengaya termasuk media selektif namun lebih berfungsi untuk
memperbanyak mikroba target sehingga saat dilakukan pengkulturan, mikroba
yang tidak diinginkan tidak dalam jumlah besar. Media pengaya harus dalam
bentuk cair dan digunakan di awal tahap analisa. Misalnya untuk memisahkan

bakteri penyakit tifus (Salmonella typhi) dari bahan tinja atau kotoran
manusia.salah satu contoh media pengkaya adalah media baird parker water
(BPW) (Barrow and Feltham, 1993).
4) Media peremajaan kultur (maintenance of cultures media)
Media peremajaan kultur mengandung nutrisi sehingga mempercepat
pertumbuhan, misalnya Nutrient Agar (NA) (Barrow and Feltham, 1993).
3. Pembuatan media
a. Media Nutrient Agar (NA) (1L)
Bahan: 23 g nutrient agar, 1000 ml aquades, label
Alat: gelas Beaker, Erlenmeyer, timbangan analitik, autoclave
Cara membuat:
1. Timbang 23 g NA, larutkan dalam 1000 ml aquades dan aduk sampai homogen,
2. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan

HCl 1 N atau NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator universal.
3. Sterilkan medium menggunakan autoclave.
b. Media Nutrient Broth (NB) (1L)
Bahan: 23 g nutrient agar, 1000 ml aquades, label
Alat: gelas Beaker, Erlenmeyer, timbangan analitik, autoclave
Cara membuat:
1. Timbang 23 g NA, larutkan dalam 1000 ml aquades dan aduk sampai homogen,
2. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan

HCl 1 N atau NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator universal.
3. Sterilkan medium menggunakan autoclave.
c. Malt Extrak (1L)
1. Timbang sebanyak gram media instant.

Catatan: Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat
gram / lt mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada
kemasan/botol media yang dipergunakan.
2. Suspensikan dalam akuadest sampai volume akhir menjadi 1000 ml.
3. Masukkan ke dalam tabung reaksi (kurang lebih 7 ml tiap tabung)
4. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs, selama 15
menit.

d. Lactose Broth (1L)
Dalam praktikum ini akan dibuat medium lactose broth dengan dua konsentrasi
(single strength dan double strength).

1. Timbang sebanyak 13gram medium lactose broth instant.
Catatan: Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat
gram / lt mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada
kemasan/botol media yang dipergunakan.

2. Suspensikan dalam akuades sampai volume akhir mencapai 1000 ml.
3. Masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
4. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121°C pada tekanan 15 lbs selama 15

menit.
5. Simpan pada tempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).
6. Prosedur yang sama dikerjakan untuk membuat double strength lactose broth,

tapi konsentrasinya dilipat duakan.
e. BGBB (Brilliant Green Bile 2 % Broth) (1L)

1. Timbang sebanyak gram medium instant.
Catatan: Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat
gram / lt mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada
kemasan/botol media yang dipergunakan.

2. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.
3. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah dilengkapi dengan tabung

Durham.
4. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121°C pada tekanan 15 lbs, selama

15 menit.
5. Simpan di tempat yang sejuk dan kering.
f. Endo Agar (1L)
1. Timbang sebanyak gram medium instant.

Catatan: Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat
gram / lt mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada
kemasan/botol media yang dipergunakan.
2. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
3. Panaskan sampai semua komponen larut.

4. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121°C pada tekanan 15 lbs, selama 15
menit.

5. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).
g. Palte Count Agar (1L)

1. Timbang sebanyak 23,5gram medium instant PCA, Pronadisa).
Catatan: Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat
gram / lt mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada
kemasan/botol media yang dipergunakan.

2. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
3. Panaskan sampai semua komponen larut (langkah ini bisa tdak dilakukan

apabila tidak mempersiapkan agar tega/agar mirin dalam tabung reaksi).
4. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121°C pada tekanan 15 lbs, selama 15

menit.
5. Media bisa dituang ke dalam cawan petri yang sudah di autoclave Untuk satu

cawan petri diameter 9,9 cm, ketebalan 1,5 cm, maka volume agar yang
diperkukan sebanyak 17,5-20 ml untuk ketebalan media agar yang baik. Agar di
tulang ke dalam cawan petri pada kondisi suhu media + 65-75°C. Pada suhu di
bawah itu agar akan membeku.
6. Biarkan agar dalam cawan petri membeku, tutup cawan di buka sampai agar
membeku (20-30 menit dalam laminar flow).
7. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas) dalam keadaan
dibungkus kantong plastik dan agar diletakkan terbalik (bagian tutup cawan petri
di bawah dan agar di atas).

ISOLASI, INOKULASI, dan PEMURNIAN (PURIFIKASI)
ISOLASI
Teknik Pengenceran Bertingkat

Sampel yang mengandung mikroorganisme dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel
dengan volume tabung pertama adalah 1:9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan
mengocoknya.

Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-
2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai
homogen (idealnya adalah dihomogenkan menggunakan vortex).

Lanjutkan pemindahan hingga tabung pengenceran terakhir (cukup sampai
pengenceran 10-6) dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur
steril yang berbeda/baru.

“Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber
yang sama”.

INOKULASI dan PEMURNIAN
Teknik ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi

dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan
koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir (pengenceran 10-4, 10-5, 10-
6).
1. Cara tebar atau sebar (spread plate method)

a. Buatlah pengenceran 10-4 sampai 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan
pengencer,

b. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher
tabung,

c. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam
cawan petri,

d. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin
(jika batang spreader terbuat dari plastik, jangan lakukan pembakaran),

e. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan
sampai permukaan agar mengering

f. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama
24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya,

Sumber: google.com Sumber: Dokumentasi pribadi
Contoh hasil isolasi

2. Cara penuangan (pour plate method)
a. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 50ºC (cirinya: terasa
hangat di kulit),
b. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol,
c. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA
secara aseptis,

d. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung
kultur murni bakteri ke dalam cawan petri,

e. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai
homogen. Penggoyangan petri jangan terlalu kuat (goyangkan membentuk seperti
angka 8). Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal
20 cm dari sumber api (zona steril),

f. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu yang berbedabeda, yaitu pada
suhu kamar, suhu 37ºC, 40ºC, 50ºC selama 48 – 72 jam. Inkubasi dengan posisi
terbalik dilakukan setelah agar memadat,

g. Amati pertumbuhannya dan lakukan perhitungan koloni menggunakan colony
counter,

h. Jumlah koloni per 1 cm2 = ¼ x 5 x jumlah koloni per cawan x 1 /faktor pengenceran,
i. Faktor pengenceran = pengenceran x volume yang diencerkan.

Sumber: google.com

3. Cara gores (streak plate method)
a. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan
ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri
(jika jarum ose yang digunakan terbuat dari plastic atau jarum ose disposable, tidak
perlu dipanaskan di atas Bunsen),
b. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai
pada satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan! (lihat Gambar 50, 51, 52). Ose
disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose
dibiarkan meluncur di atas permukaan agar,
c. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu
dan biarkan dingin, dan

d. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati
pertumbuhannya.

Sumber: Dokumentasi pribadi
Contoh beberapa hasil isolasi dengan streak plate method

PENGECATAN GRAM
A. TUJUAN

Melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif)
B. DASAR TEORI

Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan
termasuk pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram
positif dan gram negatif. Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan
Gram negative dapat diamati dengan jelas.

Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak
dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan (safranin), hal
ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat
terhadap kompleks kristal violet dan iodine (iodium).

Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara kuat, sehingga dapat
dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.

Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan
spesifik, tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi
dalam pengecatan Gram.
C. ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop cahaya
2. Objek glass
3. Jarum ose
4. Crystal violet (Gram A)
5. Larutan iodine (Gram B)
6. Alkohol 96% (Gram C)
7. Safranin (Gram D)
8. Minyak imersi
9. Isolat murni bakteri
D. PROSEDUR KERJA
1. Buatlah pulasan bakteri di atas objek glass, keringkan dan fiksasi dengan api.
2. Teteskan gram A dan diamkan 1 menit.
3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
4. Teteskan gram B dan diamkan selama 1 menit.

5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan
alkohol (kira-kira 30 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan
kesalahan hasil).

6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 2 menit.
7. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop

dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.
8. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna sel

bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi
Membuat pulasan diatas object glass Proses fiksasi diatas bunsen

Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi
Proses meneteskan gram (A, B, C, dan D) Proses pelunturan gram (A, B, C, dan D)
(dicuci dengan air mengalir)

Sumber: Dokumentasi pribadi
Preparat yang sudah jadi

E. TABEL PENGAMATAN Sifat Gram Bentuk Sel
Isolat Murni

UJI BIOKIMIA

1. Uji Oksidase
Alat dan Bahan:
a. Pipet tetes
b. larutan tetramethyl-paraphenyldiamine
c. Isolat murni bakteri
d. Kertas saring
Prosedur:
a. Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring.
b. Ambillah suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair dan inokulasikan pada
kertas saring yang telah ditetesi reagen.
c. Amati dan laporkan hasil pengujian, reaksi positif terjadi jika timbul warna ungu tua
atau hitam setelah didiamkan selama beberapa menit.
d. Kadangkala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 10-30menit.
e. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Uji Katalase
Alat dan Bahan:
a. Pipet tetes
b. Jarum ose
c. 10 % atau 30% H2O2
d. Isolat murni bakteri
Prosedur:
a. Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau
2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri.
b. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika.
c. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

3. Uji O-F (Oksidasi Fermentasi)
Alat dan Bahan
a. Tabung reaksi
b. Jarum needle
c. Isolat murni bakteri
d. 0,5-1% karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa)
e. Parafin

Prosedur:
a. Inokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri ke dalam 4 tabung berisi media OF

yang mengandung 0,5-1% karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa atau
sukrosa) secara tusukan.
b. Tabung I ditutup dengan parafin lunak, tabung II tidak ditutup parafin, tabung III dan
IV sebagai kontrol (ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokulasi bakteri).
c. Amati setelah 24 jam pada suhu kamar.
d. Bandingkan perlakuan dengan kontrol. Oksidasi (terbentuk warna kuning pada media
O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada mikroba aerobik dan fermentasi
(terbentuk warna kuning pada media O-F yang ditutup paraffin) terjadi pada mikroba
anaerob.
e. Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan warna media yang terjadi dan
indikator yang terkandung dalam media O-F.
4. Uji sitrat
Alat dan Bahan
a. Isolat murni bakteri
b. Jarum ose dan jarum needle
c. Media Simmons Citrat Agar (Instan)
Prosedur:
a. Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan
secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring
yang mengandung BCP, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.
b. Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru.
c. Bandingkan dengan control
5. Uji Dekarboksilase lisin
Alat dan Bahan
a. Isolat murni bakteri
b. Jarum needle
c. Media Lysin Iron Agar (Instan)
Prosedur:
a. Medium yang mengandung lisin dan kontrol (media tanpa lisin) diinokulasi secara
tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam

b. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning dan kembali ke ungu,
sementara pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi perubahan warna dari ungu menjadi
kuning

6. Uji Hidrolisis Gelatin
Alat dan Bahan
a. Isolat murni bakteri
b. Jarum needle
c. Tabung reaksi
d. Media gelatin (Nutrient Gelatin)
Prosedur:
a. Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yang mengandung
gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.
b. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar.
c. Pada saat pengamatan, masukkan tabung perlakuan dan kontrol (media tanpa inokulasi
bakteri) dalam almari es selama 30 menit. Positif berarti terjadi pencairan

7. Uji H2S dan fermentasi gula-gula
Alat dan Bahan
a. Media TSIA (Instan)
b. Isolat murni bakteri
c. Jarum ose
Prosedur
a. Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan
menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi.
b. Inkubasikan selama 24 jam
c. Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam. Perubahan
warna media TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula
(glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan
pecahnya media atauterangkatnya media ke atas.
d. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri)

8. Uji indol
Alat dan Bahan
a. Media Tryptone water (instan)
b. Pipet tetes

c. Isolat murni bakteri
d. Tabung reaksi
Prosedur
a. Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolate murni bakteri dan

tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
b. Inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam.
c. Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 ml larutan reagen Kovacs
d. Terbentuknya warna merah/merah muda pada lapisan larutan reagen menunjukkan

terbentuknya indol
e. Bandingkan dengan control
9. Uji MR (Methy Red) (Instan)
Alat dan Bahan
a. Isolat murni bakteri
b. Media MR-VP
c. Pipet tetes
d. Tabung reaksi
e. Reagen Methyl-Red
Prosedur:
a. Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media MethylRed-Voges

Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar.
b. Tambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke dalam tabung berisi media MR-VP
c. Kocoklah hati-hati, Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalamwaktu 30 menit

setelah penambahan reagen.
d. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
10. Uji VP (Voges Proskauer)
Alat dan Bahan
a. Tabung reaksi
b. Isolat murni bakteri
c. Media MR-VP
d. 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5%, 0,2 ml KOH 40%.
Prosedur:
a. Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP dan inkubasikan selama 24

jam pada suhu kamar.

b. Tambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%.
c. Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit,

bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit. Hasil tes positif jika terjadi warna
merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen.
d. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
11. Uji Urease
Alat dan Bahan
a. Media urea broth
b. Reagen fenol merah
c. Pipet tetes
Prosedur:
a. Inokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1
tetes kultur murni bakteri.
b. Amatilah perubahan warna menjadi merah (phenol red) setelah 24 jam pada suhu
kamar.
c. Bandingkan dengan control

Tabel Pengamatan Uji Biokimia Isolat Murni Bakteri

Uji biokimia bakteri Sample Hasil pengamatan Kesimpulan
Uji Oksidase

Uji Katalase

Uji OF

Uji Sitrat

Uji Dekarboksilasi Lisin

Uji Hidrolisis Gelatin

Uji H2S dan Fermentasi
Gula-gula

Uji Indol

Uji MR

Uji VP

Uji Urease

Daftar Rujukan
Anonim. 2016. Panduan Praktikum Mikrobiologi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma. Depok.
Anonim. 2017. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. UPN Veteran Jawa Timur. Surabaya
Anonim. 2019. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi (KES 220). Universitas Esa

Unggul. Jakarta.
Barrow, G. I., et al. 1993. Cowan and Steel’s Manual for The Identification of Medical

Bacteria. 3rd Ed. Syndicate of The University of Cambridge: United Kingdom.
Colome, JS, et al. 2001. Laboratory Exercise in Microbiology. West publishing company.

New York.
Harley, J.P. and L.M. Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. 5th Ed. The

Mc Graw Hill Companies. New York.
Lay, B., 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.

Jakarta.
Ulfah Utami, dkk. 2018. Buku Panduan Praktikum Mikrobiologi Umum. Universitas Islam

Negeri Maulana Malik Ibrahim. Malang
Zahrotul Luklukyah, dkk. 2019. Panduan Praktikum Mikrobiologi Dasar. Universitas

Tidar. Magelang.
Jurnal-jurnal mikrobiologi terkait.

Foto sampul oleh @elinmaf