Outt

เอกสารประกอบการสอน/คู่มอื ปฏิบัติการ วชิ า 135-211 ปรสิตวทิ ยาและกฏี วทิ ยาคลนิ ิก
เรื่อง Parasitology Technique

สาหรับนักศึกษาคณะเทคนิคการแพทย์ มหาวทิ ยาลัยสงขลานครินทร์ วทิ ยาเขตหาดใหญ่

เรียบเรียงโดย ผศ.ดร.สรวฒั น์ ทองสงวน

Techniques in Parasitology

วตั ถุประสงค์
1) นกั ศึกษาสามารถอธิบายวิธีการเก็บตวั อยา่ ง การเก็บรักษาและการนาส่งตวั อยา่ งชนิดต่าง ๆ มายงั

หอ้ งปฏิบตั ิการไดอ้ ยา่ งถูกตอ้ ง เหมาะสม
2) นกั ศึกษาสามารถอธิบายเทคนิค สารเคมี และการตรวจวิเคราะห์หาปรสิตสิตจากสิ่งส่งตรวจชนิด

ต่างๆ ได้
3) นกั ศึกษาสามารถบอกวิธีการยอ้ มสี และบอกการติดสีต่าง ๆ ของส่วนประกอบภายในเซลล์ปรสิต

ได้

การตรวจหาปรสิตในอจุ จาระ

การตรวจอุจจาระ มีวตั ถุประสงคเ์ พ่ือตรวจหาปรสิตที่อาศยั อยใู่ นระบบทางเดินอาหาร เช่น พยาธิ
ไส้เดือน พยาธิเส้นดา้ ย พยาธิปากขอ พยาธิใบไมใ้ นลาไส้ หรือพยาธิตวั ตืด เป็ นตน้ และปรสิตท่ีอาศยั ในตบั
และทางเดินน้าดี เช่น Entamoeba histolytica หรือพยาธิใบไมใ้ นตบั นอกจากน้ียงั สามารถตรวจหาไข่พยาธิ
ใบไมใ้ นเลือดไดด้ ว้ ย

การเกบ็ อจุ จาระ
การเก็บอุจจาระท่ีถูกวิธีจะช่วยให้การตรวจหาปรสิตในอุจจาระมีความถูกตอ้ งแม่นยามากข้ึน ควร

เก็บอุจจาระที่ถ่ายใหม่ๆ โดยถ่ายลงในภาชนะที่เก็บอุจจาระโดยตรง หรือถ่ายลงบนกระโถน หรือกระดาษ
จากน้ันใช้ไม้สะอาด (โรงพยาบาลแจกให้ หรือไม้ไอศกรีม) ตกั แบ่งอุจจาระเก็บในภาชนะสาหรับเก็บ
อุจจาระประมาณ 1-5 กรัม แต่ถา้ เป็ นอุจจาระเหลว ใหเ้ ก็บมาประมาณ 20-30 มิลลิลิตร สาหรับภาชนะที่เก็บ
อุจจาระควรเป็นภาชนะท่ีแหง้ สะอาด ฝาปิ ดมิดชิด และมีขนาดท่ีเหมาะสม

ขอ้ ควรจา

2

1) ระวงั ไม่ควรใหป้ ัสสาวะปนมาในอุจจาระ เน่ืองจากทาใหโ้ ปรโตซวั ระยะโทรโฟซอยตต์ ายได้
2) ไม่เก็บอุจจาระที่ถ่ายลงบนพ้ืนดิน เน่ืองจากอาจปนเป้ื อนพยาธิท่ีอยตู่ ามพ้ืนดิน
3) ควรเลือกเก็บอุจจาระจากหลายๆ ตาแหน่งใส่รวมกนั และถา้ สังเกตพบบริเวณท่ีผดิ ปกติ เช่น มีมูก
เลือด มีตวั หนอนปน ก็ควรเลือกเก็บบริเวณน้นั มาดว้ ย
4) เขียนช่ือ นามสกุล อายุ และวนั เวลาท่ีเก็บอุจจาระขา้ งภาชนะใหช้ ดั เจน และภาชนะเก็บอุจจาระ 1
ใบ ใชส้ าหรับผปู้ ่ วย 1 คนเทา่ น้นั
5) หากผูป้ ่ วยรับประทานยาปฏิชีวนะ ยาต้านมาลาเรีย mineral oil บิสมทั หรือแบเรียม ให้หยุด
รับประทานยาเหล่าน้ีเป็นเวลา 1 สัปดาห์หรือมากกวา่ ก่อนการเก็บอุจจาระส่งตรวจ เพราะยาเหล่าน้ีจะส่งผล
ทาใหต้ รวจหาโปรโตซวั ไดย้ าก
6) หากสงสัยผูป้ ่ วยมีเช้ือปรสิตในอุจจาระ และตรวจคร้ังแรกไม่พบปรสิต อาจมีสาเหตุมาจากมี
ปรสิตจานวนนอ้ ย หรืออยใู่ นช่วงท่ียงั ไม่เพิ่มจานวน ควรทาการเก็บอุจจาระและส่งตรวจต่อเน่ือง 3 วนั หรือ
วนั เวน้ วนั อยา่ งนอ้ ย 3 คร้ัง เพอ่ื เป็นการยนื ยนั ผลที่แน่นอน

การส่งอจุ จาระตรวจ
การตรวจอุจจาระท่ีเก็บใหม่ๆ จะให้ผลตรวจที่แม่นยามาก โดยเฉพาะอยา่ งยิ่งถา้ อุจจาระเหลว ควร

ทาการตรวจภายใน 30 นาที หลงั จากเก็บอุจจาระ ซ่ึงระยะโทรโฟซอยตข์ องโปรโตซวั ยงั สามารถเคล่ือนไหว
อยู่ได้ หากอุจจาระมีลกั ษณะอ่อน นิ่ม ควรทาการตรวจภายใน 1 ชวั่ โมงหลงั เก็บ ส่วนอุจจาระท่ีมีลกั ษณะ
ปกติ และไม่มีมูกเลือดน้นั ควรทาการตรวจภายใน 1 วนั หลงั จากเก็บ กรณียงั ไม่สามารถตรวจไดท้ นั ที ควร
ทาการเก็บรักษาตวั อยา่ งไว้ โดยแบง่ เป็ น 2 ส่วน ส่วนแรกนาอุจจาระแช่เยน็ ที่อุณหภูมิ 3-5๐C ซ่ึงไขพ่ ยาธิและ
โปรโตซวั ระยะซิสต์ สามารถอยไู่ ดน้ านหลายวนั ถึงสัปดาห์ ยกเวน้ ระยะโทรโฟซอยตไ์ ม่สามารถวนิ ิจฉยั ได้
อุจจาระอีกส่วนเก็บในน้ายา preservative สาหรับถนอมอุจจาระ มีจุดประสงคเ์ พ่ือการรักษาสภาพปรสิตให้
คงสภาพได้นาน สามารถเก็บไวต้ รวจภายหลงั ได้ โดยที่รูปร่างปรสิตไม่เปลี่ยนแปลงไปจากเดิมมากนัก
น้ายาท่ีใชใ้ นหอ้ งปฏิบตั ิการที่สาคญั มี ดงั น้ี

Polyvinyl alcohol (PVA) โดยผสมอุจจาระ 1 ส่วน กบั น้ายา 3 ส่วน กวนใหเ้ ขา้ กนั เก็บไวไ้ ดน้ านใน
ขวดที่มีฝาปิ ดมิดชิด หากน้ายาเหนียวหนืด หรือข่นุ ใหเ้ ตรียมใหม่

Schaudinn’s fixative ทาการสเมียร์อุจจาระลงบนสไลด์ แล้วนาไปแช่ในน้ายา Schaudinn โดย
สามารถเกบ็ ไวไ้ ดน้ าน 1 สัปดาห์

3

Merthiolate-Iodine-Formalin (MIF) ทาได้โดยผสมอุจจาระ 1 ส่วน กับน้ายา 3 ส่วน กวนในขวด

ปริมาตร 5 มิลลิลิตรใหเ้ ขา้ กนั

ฟอร์มาลิน 10% น้ายาชนิดน้ี เป็ นที่นิยมใช้ในห้องปฏิบตั ิการ ทาไดโ้ ดยผสมอุจจาระ 1 ส่วน ลงใน

ฟอร์มาลิน 3 ส่วน ผสมใหเ้ ขา้ กนั ดี เก็บในภาชนะท่ีปิ ดมิดชิด

การเลือกใช้น้ายาเก็บถนอมอุจจาระน้ัน ข้ึนอยู่กบั วตั ถุประสงค์ในการตรวจ และมีขอ้ ดี ข้อเสีย

แตกตา่ งกนั ดงั แสดงในตารางท่ี 5-1

ตารางที่ 5-1 เปรียบเทียบคุณสมบตั ิของน้ายาถนอมอุจจาระแตล่ ะชนิด

Preservatives Advantage Concentration Permanent Disadvantage

technique staining

PAV คงสภาพโทรโฟซอยตข์ อง Yes Yes  - มี HgCl2ผสมอยู่ เป็ นสาร
อนั ตราย
โปรโตซวั ไดด้ ี -ตวั ออ่ นของพยาธิ
Strongyloides เสียรูปร่าง
ปรสิตคงสภาพดี อยไู่ ดน้ าน

Schaudinn’s fixative คงสภาพโทรโฟซอยตข์ อง No Yes - มี HgCl2 ผสมอยู่ เป็ นสาร
โปรโตซวั ไดด้ ี Yes อนั ตราย
น้ายาเตรียมง่าย Yes

เหมาะสาหรับไขแ่ ละตวั อ่อน - ซิสตข์ องโปรโตซวั จะเสีย
MIF หนอนพยาธิ และซิสตข์ อง
No รูปร่าง หากเกบ็ ไวน้ านๆ
โปรโตซวั - ไมส่ ามารถคงสภาพโทรโฟ

ซอยตข์ องโปรโตซวั ได้

10% Formalin เหมาะสาหรับไขแ่ ละตวั อ่อน No
หนอนพยาธิ และซิสตข์ อง

โปรโตซวั

การตรวจอุจจาระ
เมื่อไดร้ ับอุจจาระมา จะทาการตรวจตามข้นั ตอนต่างๆ ดงั น้ี
1. การตรวจด้วยตาเปล่า (Microscopic examination)
เป็ นการตรวจดูลกั ษณะอุจจาระโดยทวั่ ๆ ไป ซ่ึงควรจะทาเป็ นข้นั ตอนแรกเมื่ออุจจาระถูกส่งมาถึง

ห้องปฏิบตั ิการ ใหส้ ังเกตลกั ษณะของอุจจาระ (Consistency) สีของอุจจาระ และหากพบวา่ มีมูก เลือด หรือ

4

ตวั หนอนพยาธิปนมาใหเ้ ขียนในใบรายงานผลดว้ ย โดยลกั ษณะรูปร่างของอุจจาระสามารถแบ่งประเภทได้
ดงั น้ี

-อุจจาระแขง็ (Hard stool) ใชไ้ มต้ ดั ไมไ่ ด้ อุจจาระมีความแขง็ เป็นกอ้ น
- อุจจาระปกติ (Formed stool) อุจจาระเป็ นรูปทรงกระบอก สามารถใชไ้ มต้ ดั ได้
- อุจจาระนิ่ม (Soft stool) อุจจาระเมื่ออยใู่ นภาชนะฐานจะแผอ่ อก แตส่ ่วนบนยงั เป็นกอ้ น
- อุจจาระเละ (Loose stool) เน้ืออุจจาระเมื่ออยใู่ นภาชนะจะเป็นรูปตามภาชนะน้นั
- อุจจาระน้า (Watery stool) อุจจาระเหลวเป็ นน้า
กรณีไดร้ ับอุจจาระหลายๆ กล่อง ควรเลือกตรวจอุจจาระที่มีมูกเลือดก่อน ตามดว้ ยอุจจาระท่ีเหลว
เป็นน้า เพราะอาจตรวจพบโทรโฟซอยตข์ องโปรโตซวั ได้ ซ่ึงหากตรวจชา้ อาจจะทาใหว้ นิ ิจฉยั ผดิ พลาดได้

รูปท่ี 5-1 แสดง consistency ของอุจจาระ และโอกาสในการตรวจพบโปรโตซวั ระยะโทรโฟซอยต์
(TROPHS) และระยะซิตส์ (CYSTS) ในอุจจาระแบบตา่ งๆ

(คดั ลอกจาก http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/stool/specimencoll.html)

2. การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อย่างง่าย (simple direct smear)
การตรวจน้ีทาไดง้ ่าย และสามารถทาไดใ้ นหอ้ งปฏิบตั ิการทว่ั ไป มีข้นั ตอนดงั น้ี

1) หยดน้าเกลือ 0.85% ลงบนสไลด์ 1 หยด
2) ใชไ้ มจ้ ิ้มอุจจาระจากหลายๆ บริเวณ ประมาณ 2 มิลลิกรัม (หวั ไมข้ ีด) โดยเฉพาะบริเวณที่มีความ
ผดิ ปกติ เช่น มีมูกเลือด แลว้ นามากวนกบั น้าเกลือบนสไลดใ์ หเ้ ขา้ กนั
3) ปิ ดดว้ ยกระจกปิ ดสไลด์ ระวงั อยา่ ใหม้ ีฟองอากาศ
4) นาไปตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ โดยวิธีการตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ ควรตรวจใหท้ วั่ ท้งั สไลด์
ในแนวซา้ ยไปขวา หรือบนลงล่างใหใ้ ชเ้ ลนส์วตั ถุกาลงั ขยาย 10X ก่อน จากน้นั ถา้ สงสัยวา่ มีปรสิตใหต้ รวจ
ดว้ ยเลนส์วตั ถุกาลงั ขยาย 40X เพ่อื การวนิ ิจฉยั ที่ถูกตอ้ ง

5

รูปท่ี 5-2 แสดงทิศทางการตรวจดูสไลด์ direct wet smear ซ่ึงสามารถตรวจในทิศทางซา้ ยไปขวา (A) หรือ
บนลงล่าง (B)

5) ถ้าตรวจพบระยะซิสต์ หรื อโทรโฟซอยต์ของโปรโตซัว อาจทาการย้อมสี เพื่อให้เห็น
ส่วนประกอบภายในเซลลช์ ดั เจนข้ึน โดยการยอ้ มสีมี 2 แบบ คือ

การย้อมสีชั่วคราว นิยมใช้น้ายาไอโอดีน 1% ในการยอ้ มซิสต์ โดยหยดน้ายาลงขา้ งๆ กระจกปิ ด
สไลด์ และสี Buffered Methylene Blue ใชส้ าหรับยอ้ มโทรโฟซอยต์ โดยมีเกณฑใ์ นการตรวจแสดงดงั ตาราง
ท่ี 5-2
ตารางที่ 5-2 แสดงประเภทลกั ษณะของอจุ จาระและการยอ้ มสีชวั่ คราวสาหรับตรวจอจุ จาระอยา่ งง่ายท่ีเหมาะสม

Consistency Protozoan stage most Saline Technique
likely to be found* Iodine Buffered Methylene Blue

Formed Cysts + +
+
Soft Cysts (occasionally +
trophozoites) + (if trophozoites are seen)

Loose Trophozoites + +

Watery Trophozoites + +

*ไข่พยาธิและตวั ออ่ นพยาธิมกั จะพบไดใ้ นอจุ จาระทุกประเภท

การย้อมสีแบบถาวร เป็ นการยอ้ มเพื่อให้เห็นส่วนประกอบภายในเซลล์ชดั เจนข้ึน ทาให้สามารถ
จาแนกชนิดของโปรโตซวั ไดแ้ น่นอน หรือเก็บสไลด์เพื่อการศึกษาได้ สีท่ีนิยมใชย้ อ้ มโปรโตซวั แบบถาวร
คือ Trichrome ซ่ึงห้องปฏิบตั ิการส่วนใหญ่จะเลือกใชว้ ิธีน้ี เพราะเป็ นวิธีท่ีมีข้นั ตอนไม่ยุ่งยาก และสี Iron-
Hematoxylin stain ซ่ึงมีข้นั ตอนการยอ้ มท่ีค่อนขา้ งยงุ่ ยากกวา่ และตอ้ งอาศยั ผทู้ ่ีมีความชานาญพอสมควร ใน
ท่ีน้ีจะอธิบายเฉพาะการยอ้ มสี Trichrome ซ่ึงมีข้นั ตอน ดงั น้ี

6

1. การเตรียมสเมียร์ของอุจจาระ โดยดูจากลักษณะของอุจจาระก่อน หากอุจจาระเป็ นก้อนปกติ
(formed stool) ให้นาอุจจาระมาผสมกบั น้าเกลือ เพ่ือใหอ้ ุจจาระนิ่มก่อน จากน้นั ใชพ้ ู่กนั ขนาดเล็ก จิ้มใหไ้ ด้
อุจจาระพอประมาณ แลว้ ป้ ายลงบนกระจกปิ ดสไลด์ขนาด 22 x 22 mm โดยป้ ายไปในทิศทางเดียวจากซ้าย
ไปขวา หรือขวาไปซ้ายให้เป็ นแถวจนเต็มแผน่ เพ่ือให้ไดเ้ สมียร์ท่ีมีความหนาลดหลน่ั ลงมา ทิ้งไวใ้ ห้แห้ง
หมาดๆ จากน้นั จึงนามาตรึงสภาพ (fixation) โดยแช่ สเมียร์ในโถท่ีมีน้ายา Schaudinn’s fixative อยา่ งน้อย
30 นาที สาหรับอุจจาระที่ถนอมอยูใ่ นน้ายา Schaudinn’s fixative อยแู่ ลว้ ให้กวนส่วนผสมให้เขา้ กนั ดีแลว้
หยดลงบนกระดาษซบั ใหน้ ้ายาซึมหายไป จากน้นั ปาดเอาอุจจาระทาสเมียร์บนสไลด์ และอบสเมียร์ให้แหง้
ที่ 37๐C นาน 1-2 ชว่ั โมง หรือทิง้ ไวท้ ี่อุณหภูมิหอ้ งขา้ มคืน

รูปท่ี 5-3 แสดงข้นั ตอนการทาสเมียร์ของอุจจาระ (คดั ลอกจาก Markell et al., 1992)
2. การยอ้ มสี (staining) ในข้นั แรกจะตอ้ งกาจดั ปรอทคลอไรด์ ท่ีอยใู่ นน้ายาตรึงสภาพออก โดยนา
สเมียร์ไปแช่ใน 70% Alcohol-Iodine นาน 2-5 นาที และตามดว้ ยแช่ใน 70% alcohol นาน 2 นาที 2 คร้ัง
จากน้นั จึงนาไปแช่ในสียอ้ ม โดยแช่สไลดใ์ นสี trichrome นาน 10 นาที และเขา้ สู่กระบวนการปรับสี
(destaining) เพ่ือเป็นการขจดั สีส่วนเกินออก และช่วยใหก้ ารติดสีของโปรโตซวั ชดั เจนข้ึนโดยนาสไลดจ์ ุ่ม
ลงในน้ายา 90% alcohol + acetic acid (10:1) ประมาณ 1-3 วนิ าที
3. การขจดั น้า (dehydration) โดยนาแผน่ สเมียร์ที่ปรับสีจนชดั เจนแลว้ มาจุม่ ข้ึนลงใน 100% alcohol
และยา้ ยมาแช่ใน 100% alcohol โถใหม่นาน 2-5 นาที ข้นั ตอนสุดทา้ ยยา้ ยสไลดไ์ ปแช่ใน xylene นาน 2-5
นาที 2 คร้ัง เพอ่ื เขา้ สู่กระบวนการทาใหใ้ ส (clearing) นาแผน่ กระจกปิ ดสไลดว์ างลงบนสไลดท์ ่ีมีหยดน้ายา

7

Permount หรือน้ายา mounting medium อ่ืนๆ สาหรับจดั ทาสไลดถ์ าวร และนามาตรวจหาชนิดโปรโตซวั
ภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์ กาลงั ขยาย 100X

การติดสี Nucleus, Chromatin, Karyosome, Axoneme และ Axostyle ติดสีมว่ งแดง
Cytoplasm ติดสีเขียว หรือมว่ งเขียว
Cyst wall ไม่ติดสี
Background ติดสีเขียวอ่อน

สาหรับผปู้ ่ วยโรคเอดส์ที่มีอาการอุจจาระร่วงเร้ือรัง แพทยจ์ ะส่งตรวจอุจจาระเพอ่ื หา coccidia ซ่ึง
เป็นปรสิตฉวยโอกาส โดยวธิ ีการตรวจที่เหมาะสม คือ ทาสเมียร์อุจจาระบนสไลด์ แลว้ ยอ้ มดว้ ยวธิ ี
Modified Ziehl Neelsen Acid-Fast Stain โดยมีวธิ ีการยอ้ มดงั น้ี

1. ทาสเมียร์อุจจาระบนสไลด์ ทิ้งไวใ้ หแ้ หง้
2. ทาการ fixed ใน absolute methanol นาน 3 นาที จากน้นั หยดสี Carbol fuchsin stain ใหท้ ว่ ม

สไลด์ ทิง้ ไว้ 15 นาที
3. ลา้ งสไลดด์ ว้ ยน้ากลนั่ หรือน้าประปา จนน้าท่ีไหลออกทิ้งไมม่ ีสีแดง
4. ทาการปรับสีโดยราดสเมียร์ดว้ ย acid alcohol (1% HCl ใน methanol) นานประมาณ 15-20

วนิ าที
5. ลา้ งดว้ ยน้าและยอ้ มทบั ดว้ ย 0.4% malachite green นาน 30-60 วนิ าที
6. ลา้ งออกดว้ ยน้า และวางไวใ้ หแ้ หง้ จากน้นั ทาการ mount ดว้ ย Permount แลว้ นามาตรวจดู

ภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์กาลงั ขยาย 40x และ 100x ตามลาดบั
การติดสี Oocyst ของ Cryptosporidium pavum ติดสีแดง ขนาดประมาณ 4-5 µm ภายใน
เห็นเป็ นกลุ่มกอ้ นอยชู่ ิดดา้ นใดดา้ นหน่ึง ติดสีเท่ากนั ทุกกอ้ น

Oocyst ของ Cyclospora cayetanensis ติดสีแดง แบบ variable ขนาดประมาณ 8-
10 µm โดยที่บางกอ้ นติดสีเขม้ บางกอ้ นติดสีจางๆ และบางกอ้ นอาจไมต่ ิดสี

Oocyst ของ Isospora belli มีรูปร่างรี ภายในมี sporoblast ติดสีแดง 1-2 กอ้ น ผนงั
หุม้ oocyst ไมต่ ิดสี

ยสี ตแ์ ละเมด็ เลือดขาว ติดสีเขียวน้าเงิน
เมด็ เลือดแดง ไมต่ ิดสี

8

3. การตรวจอุจจาระด้วยวธิ ีพเิ ศษอนื่ ๆ
ใช้ในกรณีการตรวจอุจจาระอยา่ งง่ายแลว้ ไม่พบปรสิต หรือเป็ นการตรวจเพ่ือยนื ยนั การติดเช้ือ

มีหลายวธิ ี ไดแ้ ก่
3.1 การตรวจสเมียร์อุจจาระแบบหนาโดยวิธี Cellophane thick smear หรือ Kato’s thick smear

technique
การตรวจสเมียร์อุจจาระอยา่ งหนาโดยวิธีของคาโต จะใชแ้ ผน่ cellophane แทนกระจกปิ ดสไลด์

วธิ ีน้ีใชป้ ริมาณอุจจาระในปริมาณที่มาก และมีการทาใหส้ ่วนประกอบอุจจาระใสข้ึนดว้ ยกลีเซอรีน ทาใหพ้ ่ิม
โอกาสในการพบไข่พยาธิ หรือปรสิตไดด้ ีกวา่ วธิ ีการตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์อยา่ งง่าย
การเตรียมแผน่ cellophane

1. นาแผ่น cellophane ชนิดที่น้าซึมผ่านไดท้ ี่มีความหนาประมาณ 40-50 µm มาตดั ให้มีขนาด
22x30 mm

2. แช่แผน่ cellophane ใน cellophane staining medium อยา่ งนอ้ ย 24 ชว่ั โมง ก่อนใชง้ าน
วธิ ีตรวจ

1. ใชไ้ มเ้ ขี่ยอุจจาระประมาณ 50-60 มิลลิกรัม วางลงบนแผน่ สไลด์ ถา้ อุจจาระท่ีตรวจมีกากมากหรือมี
ลกั ษณะหยาบควรกรองก่อน โดยใชแ้ ผน่ ตะแกรงลวดที่มีรูประมาณ 150 รู ต่อ 1 นิ้ว และกดลงบน
อุจจาระ ใช้ไมป้ าดอุจจาระบนตะแกรงลวด ให้ไดป้ ริมาณ 50-60 มิลลิกรัม แลว้ นาไปวางบนแผ่น
สไลดแ์ ผน่ ใหม่

2. ปิ ดทบั ดว้ ยแผน่ cellophane ที่เตรียมไว้
3. ใชจ้ ุกยางกดอุจจาระให้แผก่ ระจายจนเกือบเต็มแผน่ cellophane ระวงั อยา่ ให้อุจจาระลน้ ออกมา ต้งั

ทิ้งไวท้ ่ีอุณหภูมิหอ้ งนานประมาณ 30-60 นาที หรือวางไวใ้ นตูอ้ บอุณหภูมิประมาณ 40๐C นาน 20-
30 นาที แต่ตอ้ งระวงั ไม่ทิ้งไวน้ านเกิน 1 ชว่ั โมง เพราะไข่พยาธิบางชนิดอาจถูกทาลาย โดยเฉพาะ
อยา่ งยง่ิ ไข่พยาธิชนิดท่ีมีเปลือกบาง จากน้นั นามาส่องตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์
หมายเหตุ วิธีน้ีใชต้ รวจหาโปรโตซวั ไม่ได้ และไข่พยาธิค่อนขา้ งใส โดยเฉพาะไข่พยาธิท่ีมีขนาด
เล็กอาจตรวจพบไดย้ าก

3.2 การตรวจอุจจาระด้วยวธิ ีเข้มข้น
ในกรณีท่ีทาการตรวจอุจจาระแบบง่ายแลว้ ไม่พบโปรโตซัว ไข่ หรือตวั อ่อนของหนอนพยาธิ

ควรนาตวั อยา่ งอุจจาระไปตรวจดว้ ยวิธีทาให้เขม้ ขน้ ต่อไป ซ่ึงสามารถแบ่งหลกั การตรวจได้ 2 แบบ คือ การ

9

ลอยตวั (floatation) และวธิ ีการตกตะกอน (sedimentation) ท้งั 2 วธิ ีอาศยั หลกั การท่ีวา่ ไขพ่ ยาธิ และซิสตข์ อง
โปรโตซวั มีความถ่วงจาเพาะแตกต่างจากกากอาหาร โดยวิธีการลอยตวั จะใช้น้ายาท่ีมีความถ่วงจาเพาะสูง
กว่าซิสต์ หรือไข่พยาธิ ทาให้ซิสต์ หรือไข่พยาธิลอยข้ึนมาอยู่บนผิวน้ายา ในขณะท่ีกากอาหารจะจมลง
ดา้ นล่าง แต่วิธีน้ีไม่เหมาะสาหรับไข่พยาธิท่ีมีความถ่วงจาเพาะสูง และไข่พยาธิที่มีฝา วิธีท่ีนิยม คือ brine
floatation ส่วนวิธีการตกตะกอนสามารถใช้ไดก้ บั ซิสต์ และไข่พยาธิทุกชนิด แต่ส่วนที่เตรียมไดค้ ่อนขา้ ง
สกปรก วธิ ีท่ีนิยมตรวจหาไข่พยาธิ คือ formalin-ether sedimentation technique

การตรวจอจุ จาระด้วยวธิ ีเข้มข้น แบบลอยตวั ในนา้ เกลอื หรือ brine floatation technique
หลกั การ

วธิ ีการตรวจอุจจาระแบบเขม้ ขน้ ดว้ ยการลอยตวั ในน้าเกลืออิ่มตวั ที่มีความถ่วงจาเพาะ 1.200 ซ่ึงสูง
กว่าซิสต์ หรือไข่พยาธิ ทาให้ซิสต์ หรือไข่พยาธิลอยข้ึนมาอยู่ที่ผิวของน้าเกลือ ขณะท่ีกากอาหารจะตกสู่
ดา้ นล่าง วิธีน้ีทาง่าย และสามารถใช้ตรวจหาไข่พยาธิตวั กลม เช่น Hookworm, Ascaris, Trichuris และไข่
พยาธิตวั ตืด เช่น Hymenolepsis nana และ Taenia ได้ แต่ไม่เหมาะสาหรับการตรวจหาไข่พยาธิชนิดท่ีมีฝา
โดยเฉพาะไข่พยาธิใบไม้ ไข่พยาธิไส้เดือนชนิด unfertilized เน่ืองจากไข่จะจมลงขา้ งล่าง และไม่เหมาะ
สาหรับการตรวจหาตวั อ่อนของหนอนพยาธิ และซิสตข์ องโปรโตซวั เพราะน้าเกลือจะทาใหเ้ สียรูปร่าง
วธิ ีการตรวจ

1) กวนอุจจาระ 0.5-1 กรัมในน้าเกลืออ่ิมตวั ความถ่วงจาเพาะ 1.200 ประมาณ 20-25 มล.
2) กรองผา่ นผา้ ก๊อซเปี ยก หนา 1-2 ช้นั ลงในหลอดแกว้ ขนาด 15x105 มม. ใหเ้ ตม็ หรือใชห้ ลอด
หยดเติมน้าเกลืออีกจนถึงขอบปากหลอด
3) วางกระจกปิ ดสไลดบ์ นปากหลอดใหแ้ ตะกบั น้าเกลือ ต้งั หลอดใหต้ รงและน่ิงเป็ นเวลาประมาณ
30-60 นาที
4) คอ่ ยๆ ยกกระจกปิ ดสไลดไ์ ปวางบนสไลด์ แลว้ ตรวจหาซิสต์ หรือไข่พยาธิภายใตก้ ลอ้ ง
จุลทรรศน์
วิธีการตรวจแบบลอยตวั วิธีอ่ืนๆ ได้แก่ การลอยตวั ในน้าเช่ือม (sugar floatation) โดยการผสม
อุจจาระลงในน้าเช่ือมความถ่วงจาเพาะ 1.180 วธิ ีน้ีทาให้ซิสตไ์ มค่ ่อยเสียรูปร่างเหมือนการตรวจดว้ ยน้าเกลือ
และน้าเชื่อมที่มีความถ่วงจาเพาะ 1.15 เหมาะสาหรับการตรวจหา oocyst หรือ sporocyst ของ coccidian

10

การตรวจอุจจาระด้วยวธิ ีเข้มข้น แบบลอยตัวในสังกะสีซัลเฟต (zinc sulfate floatation)
วิธีน้ีจะใช้สารละลาย ZnSO4 ท่ีความถ่วงจาเพาะ 1.180 น้ายาชนิดน้ีให้ผลไดด้ ีกบั ซิสต์ของโปรโตซัว

และไขข่ องพยาธิไมเ่ สียรูปร่าง โดยมีวธิ ีทาดงั น้ี
1) ผสมอุจจาระประมาณ 1 กรัม กบั น้าใหเ้ ขา้ กนั แลว้ เทลงหลอดป่ันขนาด 15 มล. แลว้ เติมน้าลงไปจน
เกือบเตม็
2) ปั่นท่ี 1,500 rpm เป็นเวลา 1 นาที เพือ่ ใหไ้ ข่พยาธิ และซิสตต์ กสู่ดา้ นล่าง แลว้ เทส่วนใสทิ้งไป
3) เติมน้ายา ZnSO4 ลงไปประมาณ 1-2 มล. แลว้ เอาไมค้ นอุจจาระให้เขา้ กบั น้ายา เติมน้ายา ZnSO4 ลง
ไปอีก จนกระทงั่ ต่ากวา่ ปากหลอดประมาณ 2-3 มม.
4) กรองผ่านผา้ ก๊อซลงสู่ถว้ ยกระดาษ แล้วเทกลบั ลงในหลอดปั่นอีกคร้ัง เติมน้ายา ZnSO4 ลงไปจน
เกือบเตม็ ใหต้ ่ากวา่ ปากหลอดประมาณ 2-3 มม.
5) นาไปป่ันท่ี 1,500 rpm นาน 1 นาที จากน้นั ค่อยๆ หยบิ หลอดออกจากเครื่องปั่นเบาๆ วางใน rack ใช้
วงลวดที่มีเส้นผา่ นศูนยก์ ลางประมาณ 5-7 มม. แตะผวิ น้ายาในหลอดป่ัน แลว้ แตะลงบนสไลด์ซ้าๆ
ดงั แสดงในรูปท่ี 5-4
6) หยดน้ายาไอโอดีน 1 หยด คนให้เข้ากนั ปิ ดด้วยกระจกปิ ดสไลด์ แล้วนาไปตรวจภายใตก้ ล้อง
จุลทรรศน์

รูปที่ 5-4 แสดงข้นั ตอนการใชว้ งลวดแตะผวิ น้ายาในหลอดป่ัน สาหรับการตรวจอุจจาระดว้ ยวธิ ีลอยตวั ใน
สงั กะสีซลั เฟต (คดั ลอกจาก Garcia and Ash, 1979)

การตรวจอจุ จาระด้วยวธิ ีเข้มข้น แบบการตกตะกอนโดยอาศัยการปั่นในฟอร์มาลนิ กบั อเี ทอร์ (Formalin-
ether centrifugation sedimentation technique)
หลกั การ

การทาให้เขม้ ขน้ โดยการปั่นแบบใช้ฟอร์มาลินกบั อีเทอร์ จะทาให้อุจจาระตกตะกอนเร็วข้ึนโดย
อาศยั การป่ัน และใช้ฟอร์มาลินตรึงสภาพปรสิตก่อน จากน้ันจึงใช้อีเทอร์สกดั ไขมนั ออก วิธีน้ีสามารถ

11

ตรวจหาซิสตข์ องโปรโตซัว และไข่หรือตวั อ่อนของพยาธิเกือบทุกชนิด แมใ้ นอุจจาระท่ีมีส่วนประกอบ
ไขมนั มาก สามารถเก็บรักษาไวไ้ ดเ้ ป็นเวลานาน โดยที่รูปร่างของซิสต์ ไขห่ รือตวั ออ่ นพยาธิไม่เปล่ียนแปลง
ไป แต่ใช้กบั การตรวจหา Giardia และไข่ของ Hymenolepsis nana ไดไ้ ม่ค่อยดี และไม่เหมาะสาหรับงาน
สารวจภาคสนาม เนื่องจากใชเ้ คร่ืองมือ และสารเคมีหลายชนิด
วธิ ีการตรวจ
1) กวนอุจจาระประมาณ 1 กรัม กบั น้า 10-20 มล. ใหแ้ ตกกระจายดีในถว้ ยอุจจาระ กรองผา่ นผา้ กอ๊ ซเปี ยก

2 ช้นั ลงในถว้ ยใบใหม่ แลว้ ถา่ ยลงหลอดปั่น (บางหน่วยงานอาจผสมอุจจาระกบั ฟอร์มาลิน แลว้ กรอง
ผา่ นผา้ ก๊อซ จากน้นั ทาต่อในข้นั ตอนที่ 3)
2) นาไปปั่นดว้ ยความเร็ว 1,500-2,000 รอบ/นาที นาน 1-2 นาที เทน้าส่วนบนทิง้
3) ผสม 10% ฟอร์มาลินลงไปกบั ตะกอน ปริมาตร 10 มล. เขยา่ ใหเ้ ขา้ กนั ต้งั ทิง้ ไว้ 5 นาที
4) เติมอีเทอร์ลงไป 3 มล. ปิ ดหลอดดว้ ยจุกยาง แลว้ เขยา่ อยา่ งแรง ประมาณ 20-30 วนิ าที เอาจุกยางออก
5) นาไปป่ันท่ีความเร็ว 1,500-2,000 รอบ/นาที นาน 1-2 นาที ส่วนผสมจะแยกออกเป็น 4 ช้นั จากล่างข้ึน
บน ตามลาดบั ดงั น้ี ตะกอน, ฟอร์มาลิน, ขยะ/ไขมนั , อีเทอร์ ดงั รูปที่ 5-5
6) ใชไ้ มเ้ ขี่ยช้นั ไขมนั และขยะใหห้ ลุดออกจากผนงั ดา้ นในหลอดปั่น แลว้ เทท้งั อีเทอร์และฟอร์มาลินทิง้
ไป
7) ผสมตะกอนที่กน้ หลอดใหเ้ ขา้ กบั ฟอร์มาลินท่ีเหลือคา้ งใหเ้ ขา้ กนั ดี ดูดตะกอนลงบนสไลด์ หยด 1%
ไอโอดีนลงไปผสม ปิ ดดว้ ย cover glass แลว้ นาไปดูใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์
หมายเหตุ สารอีเทอร์เป็ นสารท่ีค่อนขา้ งอนั ตราย และระเหยง่าย ดงั น้นั บางหอ้ งปฏิบตั ิการอาจใช้ Ethyl
Acetate แทนอีเทอร์ เน่ืองจากมีอนั ตรายน้อยกว่า และให้ผลไม่แตกต่างกนั สาหรับห้องปฏิบตั ิการที่ขาด
แคลนอุปกรณ์ และสารเคมี สามารถทาการตรวจตกตะกอนแบบธรรมดาได้ แต่ใชเ้ วลานาน และมีส่วนของ
อุจจาระปนอยมู่ าก สามารถทาไดโ้ ดยผสมอุจจาระกบั น้าให้เขา้ กนั แลว้ กรองผา่ นผา้ ก๊อซลงในแกว้ รูปกรวย
ต้งั ทิ้งไวป้ ระมาณ 1 ชว่ั โมง เทนาดา้ นบนออก ทาการเติมน้า และเทซ้าๆ จนกวา่ น้าส่วนบนใส คร้ังสุดทา้ ยเท
น้าออก แลว้ ดูดเอาตะกอนมาตรวจ

12

รูปที่ 5-5 แสดงผลการตรวจอุจจาระดว้ ยวธิ ีเขม้ ขน้ แบบตกตะกอนดว้ ยวธิ ีฟอร์มาลินอีเทอร์ (A) และแบบ
ลอยตวั ดว้ ยน้ายา zinc sulfate (ดดั แปลงเลก็ นอ้ ยจาก Garcia and Ash, 1979)

3.3 การเพาะเลยี้ งตัวอ่อนของพยาธิตัวกลม (culture method)
วัตถุประสงค์ เพื่อทาให้จานวนพยาธิเข้มข้นข้ึน เป็ นวิธีตรวจหาการติดเช้ืออย่างอ่อน (light
infection) และมีประโยชน์ในการวนิ ิจฉยั โรคพยาธิปากขอ (Hookworm) พยาธิเส้นดา้ ย (Strongyloides) และ
พยาธิ Trichostrongyle โดยจะทาการเพาะเล้ียงจนไดเ้ ป็ นตวั อ่อนระยะติดต่อ (infective stage) ซ่ึงสามารถใช้
ในการจาแนกชนิดของพยาธิไดด้ ีกวา่ ระยะไข่
การเพาะเลยี้ งในถ่านบด (Charcoal cultures)
การเพาะเล้ียงในถ่านไมบ้ ด เป็ นวิธีการเพาะเล้ียงท่ีคล้ายคลึงกบั สภาวะธรรมชาติมาก และจะให้
พยาธิระยะติดต่อจานวนมาก มีวธิ ีทาดงั น้ี
1) ผสมอุจจาระปริมาณ 20-40 กรัมกบั น้า เพอ่ื ใหม้ ีความเหนียวพอสมควร แตอ่ ยา่ ใหแ้ ฉะมาก
2) เตรียมถ่านไมข้ นาดประมาณ 2-3 มม3 หรือใช้ No. 10 granulated hardwood charcoal ในภาชนะขาด
ประมาณ 4 x 3 นิ้ว ใหส้ ูงประมาณคร่ึงหน่ึงของภาชนะ
3) ผสมอุจจาระกบั ถ่านบดให้เขา้ กนั อยา่ งดี อย่าให้เหลือเป็ นกอ้ น พรมน้าเล็กน้อยเพ่ือเพ่ิมความช้ืน
ระวงั อยา่ ใหแ้ ฉะ

13

4) ปิ ดฝาภาชนะ และเกบ็ ไวใ้ นท่ีมืด ท่ีอุณหภูมิหอ้ งนานประมาณ 5-6 วนั โดยจะตอ้ งพรมน้าทุกวนั เพ่ือ
ป้ องกนั ไม่ใหถ้ ่านแหง้ จนไดต้ วั ออ่ นระยะติดต่อ

5) ทาการเก็บตวั ออ่ นโดยตดั ผา้ ก๊อซหนา 10-12 ช้นั เยบ็ ขอบใหต้ ิดกนั ชุบน้าใหห้ มาดๆ แลว้ ใช้ forceps
คีบนาไปวางใหค้ ลุมผวิ ถ่าน ระวงั อยา่ ใหถ้ ูกมือ เน่ืองจากพยาธิตวั อ่อนสามารถไชได้

6) ส่องผวิ หนา้ ถ่านดว้ ยโคมไฟคอห่าน โดยใหห้ ลอดไฟห่างจากผวิ หนา้ ถ่านประมาณ 6-8 นิ้ว ตวั อ่อน
จะเคลื่อนท่ีมายงั แผน่ ผา้ ก๊อซ

7) หลงั จากส่องไฟประมาณ 1 ชว่ั โมง ค่อยๆ คีบผา้ ก๊อซไปวางลงบนตะแกรงลวดของ Baermann’s
apparatus ดงั แสดงในรูปที่ 5-6

8) หลงั จากวางทิ้งไวป้ ระมาณ 30 นาที ตวั อ่อนพยาธิจะลงไปในน้าและตกตะกอนอยใู่ นท่อยาง ให้เก็บ
น้าจากท่อยางประมาณ 10 มล. ลงในหลอดป่ัน ทิ้งไวส้ ักครู่ หรือนาไปปั่น จะเห็นตะกอนของตวั
อ่อนพยาธิอยทู่ ่ีกน้ หลอด

รูปท่ี 5-6 แสดงลกั ษณะของ Baermann’s apparatus (ดดั แปลงเลก็ นอ้ ยจาก Markell et al., 1992)
Harada-Mori Filter Paper Strip Culture

วธิ ีการเพาะเล้ียงพยาธิของ Harada-Mori เป็นการเพาะเล้ียงใหไ้ ดต้ วั อ่อนนะยะติดต่อของพยาธิ
ปากขอ พยาธิเส้นดา้ ย และพยาธิ Trichostrongyle โดยมีวธิ ีทาดงั น้ี

1) ตดั กระดาษกรอง (Whatman No.2 ใหไ้ ดข้ นาด 14 X 135 มม.)
2) ป้ ายอุจจาระลงตรงกลางกระดาษ ใหม้ ีปริมาณอุจจาระ 0.5-1 กรัม อยา่ ป้ ายหนาจนเกินไป เพราะ

จานวนไขท่ ่ีฟักจะนอ้ ย หา้ มใชก้ บั อุจจาระแช่เยน็ เพราะไข่ Necator americanus จะไม่เจริญเติบโต

14

3) สอดกระดาษกรองที่มีอุจจาระลงในหลอดแกว้ ขนาด 16 X 126 มม. หรือหลอดป่ัน 15 มล. ท่ีมีน้าอยู่
กน้ หลอดประมาณ 4-5 มล. ระวงั ไมใ่ หอ้ ุจจาระถูกน้า ดงั แสดงในรูปท่ี 5-7

4) นาไปไวใ้ นที่มืด 5-10 วนั จะไดต้ วั อ่อนระยะ filariform ระวงั อยา่ ใหน้ ้าแหง้ ถา้ น้าลดระดบั ใหเ้ ติม
ลงไปอีก

5) ใช้ Pasture pipette ดูดน้าจากกน้ หลอดมาใส่บนสไลด์ หยด 1% iodine หรือ 20% acetic acid ลงไป
เพือ่ ฆ่าตวั อ่อน และตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ ระวงั อยา่ ใหม้ ือสมั ผสั กระดาษกรอง เพราะตวั อ่อน
Strongyloides จะเคล่ือนท่ีท้งั ขา้ งบนและล่างของกระดาษกรอง

Filter paper/slant culture technique
วธิ ีการเพาะเล้ียงในจานแกว้ เป็นวธิ ีการเพาะเล้ียงพยาธิ เพ่ือใหไ้ ดพ้ ยาธิระยะติดต่อ (infective stage)

และตวั เตม็ วยั ระยะ free-living ของพยาธิเส้นดา้ ย (Strongyloides) มีวธิ ีทาดงั น้ี
1) ตดั กระดาษกรองใหม้ ีขนาด 1 x 3 นิ้ว ซบั น้าใหเ้ ปี ยก และจดั วางบนสไลด์
2) ป้ ายอุจจาระประมาณ 1-2 กรัมบางๆ ตรงกลางกระดาษกรอง
3) นาไปจดั วางใน petri dish ที่มีแท่งแกว้ อยู่ โดยวางดา้ นหน่ึงของสไลดล์ งบนแทง่ แกว และอีกดา้ นจุ่ม
ลงในน้า ดงั แสดงในรูปที่ 5-7
4) ปิ ดฝา และเก็บไวใ้ นที่มืด ท่ีอุณหภูมิหอ้ ง โดยสามารถตรวจดูพยาธิระยะ free-living adultและตวั
อ่อนระยะติดต่อไดท้ ้งั บนเน้ืออุจจาระ และในน้ารอบๆ สไลด์

รูปท่ี 5-7 แสดงการเพาะเล้ียงพยาธิดว้ ยวธิ ี Harada-Mori Filter Paper Strip (A) และวธิ ี Filter paper/slant
culture technique (B) (ดดั แปลงเลก็ นอ้ ยจาก Garcia and Ash, 1979)

Agar Plate Culture Technique
วิธีการเพาะเล้ียงในจานวุน้ เป็ นวิธีท่ีมีความไวสูงในการตรวจหา Strongyloides ในอุจจาระ มีวิธีทา

ดงั น้ี

15

1) ละลาย Nutrient Agar 3.5 กรัม ในน้ากลนั่ 100 มล. ตม้ จนละลายดี แลว้ นาไป autoclave
2) เทใส่ petri dish พลาสติกขนาด 15 X 100 มม. ใหว้ นุ้ แผท่ วั่ กน้ จาน ปิ ดฝาจานต้งั ทิง้ ไวจ้ นวนุ้ แขง็ ตวั ดี
3) ตกั อุจจาระประมาณ 4 กรัม หรือขนาดหวั แม่มือ ใส่กลางจานวนุ้ ปิ ดฝา และใชเ้ ทปกาวใสพนั รอบจาน

วางทิ้งไวท้ ี่อุณหภูมิหอ้ ง
4) ตรวจดูผิววุ้นทุกวัน ด้วยกล้อง inverted microscope เพ่ือหารอยเล้ือยพยาธิปากขอ หรื อพยาธิ

Strongyloides และหาตวั ออ่ น หรือ ตวั แก่ free living ของ Strongyloides ทาการตรวจดูทุกวนั ถา้ ครบ 5
วนั แลว้ ไมเ่ จอ ถือวา่ Negative
5) ถา้ พบแต่รอยเล้ือย ให้เจาะรูที่ฝาจานดว้ ยแท่งเหลก็ ร้อน ใส่ 10% formalin ใหท้ ่วมผิววนุ้ ทิ้งไว้ 30 นาที
แลว้ ดูดใส่หลอดปั่น ปั่นเอาตะกอนมาตรวจหาตวั อ่อนพยาธิระยะฟิ ลาริฟอร์ม
การวนิ ิจฉยั แยกตวั อ่อนระยะติดตอ่ (filariform larva) จากการเพาะเล้ียงไขพ่ ยาธิจากอุจจาระผปู้ ่ วย

รูปที่ 5-8 แสดงตวั อ่อนระยะ filariform ของพยาธิชนิดตา่ งๆ ที่พบในอุจจาระ; A=Anus, E=Esophagus,
I=Intestine, S=Sheath (Scale : 100 µm) (ดดั แปลงจาก Beaver et al., 1984)

16

การตรวจหาไข่พยาธิเขม็ หมุด (Enterobius vermicularis)
ไข่พยาธิเข็มหมุด จะตรวจพบในอุจจาระได้ยากมาก มีโอกาสพบในอุจจาระเพียง 5% เท่าน้ัน
เน่ืองจากพยาธิตวั เมียจะมีพฤติกรรมออกมาวางไข่ในบริเวณรอบๆรูทวารหนกั ในเวลากลางคืน ดงั น้นั การ
ตรวจหาไข่พยาธิเขม็ หมุดจึงมีหลกั การง่ายๆ โดยการนาเอาเทปกาวใสดา้ นกาวเหนียวมาแปะรอบๆ รูทวาร
หนัก แลว้ นามาตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ ซ่ึงช่วงเวลาที่เหมาะสมท่ีสุดในการตรวจ คือ ช่วงเช้าหลงั จาก
ผปู้ ่ วยต่ืนนอน ก่อนอาบน้าหรือถ่ายอุจจาระ โดยจะกล่าวถึงวิธี scotch tape technique ของ CDC (Center for
Disease Control) ดงั น้ี
1. ตดั เทปกาวใส ยาวประมาณ 2 นิ้ว แลว้ ทาบลงบนกระจกสไลด์ตามแนวยาว โดยให้ดา้ นเหนียวติด
กบั สไลด์ และแปะออ้ มไปดา้ นหลงั เล็กนอ้ ย
2. วางสไลดบ์ นไมก้ ดลิ้นโดยใหไ้ มโ้ ผล่พน้ สไลด์ ประมาณ 1 นิ้ว
3. แกะปลายเทปกาวจากสไลด์ แลว้ ดึงออ้ มให้ครอบไมก้ ดลิ้น ทาใหด้ า้ นกาวเหนียวของเทปหนั ออก
ดา้ นนอก
4. ใชม้ ือที่ถนดั จบั ไมก้ ดลิ้นและสไลด์ แลว้ นาไปแปะรอบๆ ทวารหนกั
5. เสร็จแลว้ ดึงเทปกาวมาติดกลบั บนสไลดเ์ หมือนเดิม
6. นาไปตรวจหาไขพ่ ยาธิเขม็ หมุดภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์

รูปท่ี 5-9 แสดงข้นั ตอนการตรวจหาไข่พยาธิเขม็ หมุดดว้ ยวธิ ี scotch tape technique
(คดั ลอกจาก Garcia and Ash, 1979)

17

สรุปข้ันตอนการตรวจอุจจาระในงานประจาวนั (Routine procedures employed for fecal examination)

เม่ือไดร้ ับตวั อย่างอุจจาระจากผปู้ ่ วย ควรทาการตรวจทนั ทีหรือเก็บไวใ้ นน้ายาถนอมอุจจาระเพื่อ
ทาการตรวจภายหลงั หรือส่งตรวจยงั สถาบนั อ่ืน การตรวจเริ่มจากการตรวจอยา่ งง่ายดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์
และยอ้ มสีชว่ั คราวในรายที่สงสัยวา่ อาจมีโปรโตซัว และตามดว้ ยการยอ้ มสีถาวรในกรณีที่ตอ้ งการจาแนก
ชนิดของโปรโตซวั ใหถ้ ูกตอ้ งแม่นยา โดยการเลือกใช้วธิ ีสาหรับการตรวจวินิจฉยั ปรสิตน้นั ข้ึนอยกู่ บั ความ
เหมาะสมแต่ละหอ้ งปฏิบตั ิการ และสามารถสรุปเป็นแผนผงั ไดด้ งั น้ี

อุจจาระ

ตรวจดว้ ยตาเปล่า เกบ็ อุจจาระถนอมในน้ายา

การตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์อยา่ งง่าย

การยอ้ มสีชวั่ คราว ส่งตรวจไปยงั สถาบนั อ่ืน

การยอ้ มสีถาวร
การตรวจอุจจาระแบบเขม้ ขน้

18

การตรวจหาปรสิตในกระแสเลอื ด

การตรวจเลือดเป็ นการวนิ ิจฉยั การติดเช้ือปรสิตท่ีอยใู่ นกระแสเลือด และเม็ดเลือดต่างๆ ไดแ้ ก่ เช้ือ
มาลาเรีย, พยาธิฟิ ลาเรีย ระยะ microfilaria, Leishmania และ Trypanosome เป็นตน้

การวนิ ิจฉัยมาลาเรียทางห้องปฏิบัตกิ าร
1. เลอื ดทใี่ ช้เตรียม Blood smear
นิยมใชก้ ารเจาะเลือดจาก peripheral blood โดยเจาะจากปลายนิ้วดว้ ยเขม็ ปราศจากเช้ือ เพราะเลือดที่เจาะ

โดยใชส้ ารกนั เลือดแขง็ จะทาใหส้ เมียร์ thick blood film หลุดจากแผน่ สไลดไ์ ดง้ ่าย และเม่ือยอ้ มสีจะไม่สวย
2. อปุ กรณ์สาหรับเตรียม Blood smear
- กระจกสไลด์ จะตอ้ งสะอาด ปราศจากไขมนั ก่อนใชง้ านควรลา้ งทาความสะอาดโดยแช่ในน้า
ผสมน้ายาซักฟอก ถูด้วยผา้ สะอาด และล้างดว้ ยน้าสะอาด ทิ้งไวใ้ ห้แห้ง จากน้ันแช่ใน 95%
แอลกอฮอล์ และเช็ดใหแ้ หง้ ดว้ ยผา้ สะอาดอีกคร้ัง
- Lancet หรือเขม็ เจาะปลายนิ้ว ควรใชเ้ ขม็ เจาะท่ีใหม่ และสะอาด ปราศจากเช้ือ
- สาลี
- แอลกอฮอล์ 70%
- ปากกาเขียนแกว้ หรือดินสอสาหรับการ label ขอ้ มูลลงบนแผน่ สไลด์
- กระจกสไลดต์ วั ไถ (spreader) สาหรับการทาฟิ ลม์ เลือดแบบบาง
3. การเจาะเลอื ดจากปลายนิว้ (Blood pricking) มีหลกั เกณฑ์ ดงั นี้
1. โดยปกติเลือกเจาะเลือดจากปลายนิ้วกลางหรือนิ้วนาง
2. ทาการบีบนวดนิ้วมือท่ีจะเจาะเบาๆ ใชส้ าลีชุบแอลกอฮอล์ 70% ทาความสะอาดปลายนิ้ว
3. เจาะดว้ ย lancet ที่ใหม่และสะอาดดว้ ยความลึกพอควร จากน้นั ใหเ้ ช็ดเลือดหยดแรกออกแลว้ บีบ

ท่ีนิ้วผปู้ ่ วยคอ่ ยๆ ใหเ้ ลือดออกมาเป็นหยด
4. จบั แผน่ สไลด์ที่ขอบ แลว้ แตะหยดเลือดลงบนสไลด์ ควรหงายมือแลว้ คว่าแผน่ สไลด์ให้แตะกบั

หยดเลือด และพยายามอยา่ ใหแ้ ผน่ สไลดส์ มั ผสั กบั บริเวณปากแผลท่ีนิ้วของผปู้ ่ วย
วธิ ีทาฟิ ล์มบาง (Thin film)

1. ใชเ้ ลือดหน่ึงหยดจากหลอด capillary หรือใชก้ ระจกสไลดแ์ ตะหยดเลือดบริเวณท่ีเจาะใหห้ ่างจาก
ปลายขอบประมาณ 1 ซม.

19

2. หงายกระจกสไลด์ แลว้ ใชส้ ไลด์ตวั ไถ (spreader) ที่มีขอบเรียบแตะหยดเลือด เอียงกระจกตวั ไถ
ใหท้ ามุม 30–45 ๐C กบั กระจกสไลด์

3. เมื่อเลือดแผก่ ระจายไปเต็มหนา้ กระจกสไลด์ตวั ไถ ให้ไถไปขา้ งหนา้ ในลกั ษณะนาเลือดไปดว้ ย
น้าหนกั และความเร็วสม่าเสมอ ดงั แสดงในรูปท่ี 9 ถา้ มุมระหวา่ งกระจกสไลดท์ ้งั สองกวา้ ง หรือ ไถเร็ว จะ
ทาใหฟ้ ิ ลม์ น้นั หนาเกินไป และถา้ ทามุมแคบ และไถชา้ จะทาใหฟ้ ิ ลม์ น้นั บางเกินไป

4. ฟิ ล์มบางก่อนย้อมสี ต้องตรึงสภาพ (Fixation) ด้วย Methyl alcohol ก่อน เพื่อยึดตรึงสี ของ
ฮีโมโกลบิน (Haemoglobin) และป้ องกนั ไมใ่ หเ้ มด็ เลือดแตก ขณะยอ้ มสีหรือถูกกบั น้า

5. สาหรับ thin film หลงั จาก fixed แลว้ สามารถเก็บไวว้ ินิจฉัยทีหลงั ไดโ้ ดยห่อดว้ ยกระดาษ และ
เขียนกากบั ไว้ จากน้นั เก็บในโถดูดความช้ืน หรือเก็บไวใ้ นตเู้ ยน็ ไดห้ ลายเดือน

รูปที่ 5-10 แสดงข้นั ตอนการทา thin blood film (A) และลกั ษณะของ thin film ที่ดี (B) (ลูกศรแสดง
ทิศทางในการตรวจหาปรสิตในเลือด โดยตาแหน่งที่ดีเมด็ เลือดแดงจะมีรูปร่างกลม และกระจายตวั

สม่าเสมอ) (ดดั แปลงเลก็ นอ้ ยจาก Markell et al., 1992)
วธิ ีทาฟิ ล์มหนา (Thick film)

ในการทาฟิ ล์มเลือดแบบหนา ทาไดโ้ ดยใช้กระจกสไลด์ไปแตะเลือดกลางแผ่นกระจก แลว้ ใชม้ ุม
กระจกสไลด์อีกแผ่นหน่ึง หรือ ปลายเข็มท่ีใช้เจาะเลือดเกล่ียกระจายหยดเลือดน้ันออกไป ให้เป็ นรูป
ส่ีเหลี่ยมจตั ุรัส ที่มีขนาดพอเหมาะ หรือเป็ นรูปวงกลม ควรให้มีความหนาพอท่ีจะทาบบนตวั หนงั สือพิมพ์
หมึกดาพออ่านได้ และฟิ ลม์ หนามาตรฐาน ควรจะมีเมด็ เลือดขาวโดยเฉลี่ย 15 – 20 เมด็ ต่อหน่ึง field ภายใต้
กาลงั ขยาย 100x ถา้ ฟิ ลม์ หนาเกินไปจะทาใหป้ ระสิทธิภาพการติดสีไมด่ ี และอาจหลุดจากสไลดไ์ ดง้ ่าย

Thick film จะตอ้ งทาการ Haemolyse เม็ดเลือดแดงก่อนการยอ้ ม ดงั น้นั จะตอ้ งแห้งสนิทก่อน และ
ไมต่ อ้ งทาการตรึงสภาพ

20

รูปที่ 5-11 แสดงข้นั ตอนการทา thick blood film (ดดั แปลงเล็กนอ้ ยจาก Markell et al., 1992)
การทาฟิ ล์มหนา และบางในแผ่นเดียวกนั

ในทอ้ งที่ท่ีมีการระบาดของมาลาเรีย อาจทาthin film และ thick film ในแผ่นเดียวกนั เพื่อความ
ประหยดั โดยหยดเลือด 2 แห่ง ในสไลด์แผน่ เดียวกนั โดยดา้ น thick film มีพ้ืนท่ี 1 ใน 3 และดา้ น thin film
มีพ้ืนท่ี 2 ใน 3 ของสไลด์ โดยดา้ น thin ควรทาก่อน เพื่อป้ องกนั เลือดแห้งก่อนไถ และเมื่อตรึงสภาพ ควร
ระวงั ไมใ่ ห้ alcohol ถูกดา้ น thick film

ขอ้ ดีของฟิ ลม์ บาง (Thin film) คือ ใชส้ าหรับเริ่มการวนิ ิจฉยั แยกเช้ือ โดยจะช่วยใหเ้ ห็นลกั ษณะ และ
การติดสีของเช้ือไดช้ ดั เจน

ขอ้ ดีของฟิ ล์มหนา (Thick film) คือ ใช้ในกรณีที่ต้องตรวจผูป้ ่ วย เป็ นจานวนมาก ๆ ซ่ึงเป็ นงาน
ประจาวนั ในการให้บริการผปู้ ่ วยโดยเฉพาะมาลาเรียคลินิก เพื่อประหยดั เวลาในการตรวจ ท้งั น้ีเพราะพ้ืนท่ี
ของฟิ ล์มเลือดไม่กวา้ งมากนกั และช่วยให้มีโอกาสตรวจพบเช้ือไดร้ วดเร็วข้ึน เพราะมีการใช้ปริมาณเลือด
มากกวา่ การเตรียมดว้ ยวธิ ีฟิ ลม์ บาง
การย้อมสีฟิ ล์มเลอื ด

สาหรับหอ้ งปฏิบตั ิการมาลาเรีย หรือมาลาเรียคลินิก ของกรมควบคุมโรค จะใชส้ ี Giemsa เป็ นหลกั
ในการสียอ้ มฟิ ลม์ เลือด ส่วนสีที่ใชก้ นั มากตามสถานพยาบาลอื่น ๆ กค็ ือสี Wright’s หรือ Wright-Giemsa
วธิ ีการยอ้ มสีฟิ ลม์ หนาโดยใชส้ ี Giemsa

- ยอ้ มฟิ ล์มเลือดนานประมาณ8-10 นาที ดว้ ย 10% Giemsa (ผสม stock Giemsa กบั Buffer pH 7.2
หรือน้าสะอาดในอตั ราส่วน 1:9)

21

- ลา้ งดว้ ยน้าสะอาดหรือ Buffer

- ปล่อยฟิ ล์มเลือดให้แห้งตามธรรมชาติหรือใช้เคร่ืองไฟฟ้ าช่วย เช่น พดั ลม และไม่ควรใช้ความ

ร้อนเนื่องจากจะทาใหฟ้ ิ ลม์ ที่ยอ้ มสีแลว้ น้นั เปลี่ยนสีไปจากเดิม

วธิ ีการยอ้ มสีฟิ ลม์ บางโดยใชส้ ี Giemsa

- หยด Methyl alcohol ใหท้ ว่ มฟิ ลม์ บางเพื่อ fix ฮีโมโกลบิน 5-10 วนิ าที

- เท Methyl alcohol ออก แล้วเทสียอ้ ม 10% Giemsa ลงไปในฟิ ล์มให้ท่วมโดยใช้เวลายอ้ ม 8-10

นาที

- ใชน้ ้าประปาลา้ งสีออก (อยา่ เทสีออกจากฟิ ลม์ เลือดเพราะจะทาใหเ้ กิดตะกอนบนฟิ ลม์ )

- ตากฟิ ลม์ ใหแ้ หง้ บน slide rack

การยอ้ มสีด้วยสี Wright-Giemsa วิธียอ้ ม โดยท่วั ไปนิยมใช้ยอ้ มฟิ ล์มบางเท่าน้ัน สีที่เตรียมข้ึนหรือที่มี

จาหน่ายมีข้นั ตอนดงั ตอ่ ไปน้ี คือ

- ตรึงสภาพฟิ ลม์ เลือดบนสไลดโ์ ดยการจุม่ ใน Methyl alcohol 5-10 วนิ าที

- หงายสไลดด์ า้ นฟิ ลม์ เลือดข้ึน หยดสีใหท้ ่วมฟิ ลม์ เลือดทิ้งไว้ 3 นาที

- หยด Buffer pH 7.2 ในปริมาตรเท่าๆ กบั สียอ้ มทิ้งไว้ 5 นาที

- ใชน้ ้ากลนั่ หรือ buffer เทลา้ งสีบนฟิ ลม์ เลือดออก แลว้ ผ่งึ ฟิ ลม์ ใหแ้ หง้ ก่อนนาไปตรวจ

การยอ้ มดว้ ย Field’s stain เหมาะสาหรับ thick film เพราะใชเ้ วลานอ้ ยโดยสียอ้ มมี 2 กลุ่ม คือ

Solution A

Medicinal methylene blue 0.8 g

Azure 1 0.5 g

Na2HPO4 5.0 g
KH2PO4 6.25 g
น้ากลน่ั 500 ml

Solution B

Eosin 1.0 g

Na2HPO4 5.0 g
KH2PO4 6.25 g
น้ากลน่ั 500 ml

22

- จุม่ film เลือดลงใน solution A 3 วนิ าที
- แตะปลายสไลดล์ งบนกระดาษกรอง เพอ่ื ซบั สีส่วนเกิน
- จุม่ สไลดล์ งในน้ากลนั่ 2-3 วนิ าที
- จุ่มสไลดล์ งใน solution B 3 วนิ าที
- แตะปลายสไลดล์ งบนกระดาษกรอง เพ่อื ซบั สีส่วนเกิน
- จุม่ สไลดใ์ นน้ากลนั่ 5 นาที เพื่อลา้ ง Eosin ท่ีมากเกินออก จากน้นั ทิง้ ไวใ้ หแ้ หง้

การติดสี
Nucleus ของเช้ือมาลาเรียติดสีม่วงแดง
Cytoplasm ของเช้ือมาลาเรียจะติดสีน้าเงินปนเทา
Malaria pigment ติดสีน้าตาลดา
Stippling ติดสีส้มแดง ชมพู
เมด็ เลือดแดงติดสีม่วงเทาจางๆ
เมด็ เลือดขาว นิวเคลียสติดสีมว่ งแดง หรือน้าเงินเขม้ ; cytoplasm ติดสีฟ้ า; granules

ของ eosinophil ติดสีส้มแดง; granules ของ basophil ติดสีมว่ งน้าเงิน
เกลด็ เลือด ติดสีม่วงแดง

การนับจานวนเชื้อมาลาเรียจากฟิ ล์มเลอื ด
การนบั จานวนเช้ือมาลาเรียจากฟิ ล์มเลือดมีความสาคญั ในการประเมินความรุนแรงของการติดเช้ือ

โดยฟิ ลม์ เลือดบาง จะนิยมตรวจดูบริเวณค่อนไปทางปลายสเมียร์ (รูปที่ 5-10B) เน่ืองจากเป็ นบริเวณที่เม็ด
เลือดแดงมีรูปร่างกลมปกติ และมีการประจายตวั สม่าเสมอ ไม่ซ้อนทบั กนั มีเม็ดเลือดแดงเฉลี่ย 200-250
cells/oil field โดยทาการนับเช้ือมาลาเรียแยกตามสปี ชีส์ และระยะของเช้ือต่อจานวนเม็ดเลือดแดง 1000
cells หรือตรวจดูอย่างน้อย 200-300 oil fields ใช้เวลาตรวจประมาณ 15-20 นาทีต่อแผ่นสไลด์ แล้ว
เปรียบเทียบเป็นร้อยละตอ่ เมด็ เลือดแดง

สาหรับการนบั จานวนเช้ือมาลาเรียในฟิ ล์มเลือดแบบหนา ควรตรวจดูบริเวณท่ีมีเม็ดเลือดขาวเฉล่ีย
3-5 cells/ oil field โดยตรวจนบั จานวนเช้ือมาลาเรียแยกระยะและสปี ชีส์ต่อเม็ดเลือดขาว 200 cells ตรวจดู
อยา่ งนอ้ ย 100 oil fields ใชเ้ วลาตรวจประมาณ 5 นาทีตอ่ แผน่

23

การตรวจเลอื ดเพอ่ื หาไมโครฟิ ลาเรีย
1. การเกบ็ ตัวอย่างเลอื ด
การเจาะเลือดผูป้ ่ วยเพ่ือตรวจหาไมโครฟิ ลาเรีย จะนิยมเจาะเลือดจากปลายนิ้วมากกว่าเจาะจาก

หลอดเลือดดา เพราะจะทาใหพ้ บไมโครฟิ ลาเรียไดม้ าก และควรคานึงถึงช่วงเวลาที่ไมโครฟิ ลาเรียออกมาใน
กระแสเลือดดว้ ย (periodicity) ซ่ึงในประเทศไทยพบรูปแบบ periodicity ดงั น้ี

Wucheraria bancrofti พบได้ 2 แบบ คือ Nocturnally periodicity พบมากในผูป้ ่ วยต่างดา้ วชาวพม่า
โดยจะตรวจพบเช้ือได้สูงสุดในตอน 22.00 – 2.00 น. และแบบ Nocturnally subperiodicity ซ่ึงพบได้ใน
ประชากรไทยท่ีอาศยั อยใู่ นพ้นื ที่เขตชายแดนไทย-พม่า

Brugia malayi พบได้ 2 แบบ คือ Nocturnally subperiodicity ซ่ึงพบได้ท่ัวไปในแถบภาคใต้ของ
ไทย และแบบ Diurnally subperiodicity ซ่ึงสามารถตรวจพบเช้ือไดส้ ูงในช่วงเวลากลางวนั และตอนเท่ียง
พบไดส้ ูงที่สุด ในประเทศไทยมีรายงานพบไมโครฟิ ลาเรียของ B. malayi รูปแบบน้ีที่ อ.พระแสง จ.สุราษฎร์
ธานี

2. เทคนิคการตรวจวนิ ิจฉัยหาไมโครฟิ ลาเรียในตวั อย่างเลอื ด
2.1)การตรวจอย่างง่าย (direct smear) ทาได้โดยการเจาะเลือดจากปลายนิ้ว 1 หยด ผสมกบั Normal
Saline 1 หยดบนสไลด์ คนใหเ้ ขา้ กนั แลว้ ปิ ดดว้ ยกระจกปิ ดสไลด์ แลว้ นาไปตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ จะ
เห็นการเคลื่อนไหวของไมโครฟิ ลาเรีย หรืออีกวิธีท่ีนิยม คือการทา thick smear ตามวิธีของ Sasa (1967)
เป็ นการทาฟิ ล์มเลือดแบบหนาแนวยาว 3 แถว โดยใช้เลือด 30 µl ท้งั ให้แห้ง แล้วทากระบวนการยอ้ มสี
Giemsa เหมือนข้นั ตอนการยอ้ มสีฟิ ล์มเลือดแบบหนาของเช้ือมาลาเรีย ซ่ึงวิธีน้ีสามารถนบั จานวนไมโครฟิ
ลาเรียในกระแสเลือดไดด้ ว้ ย
2.2)การตรวจแบบเขม้ ขน้ ซ่ึงในที่น้ีจะอธิบายวิธี Knott concentration technique ทาไดโ้ ดย ผสมเลือด 1
มล. กับฟอร์มาลินความเข้มขน้ 2% ปริมาตร 9 มล. ต้งั ทิ้งไวใ้ ห้เม็ดเลือดแดงแตก จากน้ันจึงนาไปป่ันท่ี
1,500 รอบ/นาที นาน 2 นาที แลว้ นาตะกอนมาสเมียร์บนสไลด์ ทิ้งใหแ้ หง้ แลว้ นาไปยอ้ มสี 10% Giemsa
2.3)การกระตุ้นด้วย Diethylcarbamazine วิธีน้ีเป็ นการใช้ยาไปกระตุ้นให้ไมโครฟิ ลาเรียออกมาใน
กระแสเลือดในช่วงเวลากลางวนั โดยทาการเจาะเลือดเพอื่ ตรวจหาไมโครฟิ ลาเรีย 1-2 ชว่ั โมงหลงั ใหย้ า วธิ ีน้ี
ไม่ตอ้ งคานึงถึง periodicity ของเช้ือ

24

เทคนิคการตรวจวนิ ิจฉัย Leishmaniasis ในตวั อย่างเลอื ด
การตรวจหาเช้ือ Leishmania ในกระแสเลือดนิยมทาโดยการเจาะเลือดใส่ใน capillary tube จากน้นั

นาไปปั่นเช่นเดียวกบั การปั่นฮีมาโตคริต แลว้ นาช้นั buffy coat ซ่ึงเป็ นช้นั ที่มีเมด็ เลือดขาวอยมู่ าก มาสเมียร์
ลงบนสไลด์ ทิ้งใหแ้ หง้ ยอ้ มดว้ ยสี Giemsa แลว้ นามาตรวจดูภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์

เทคนิคการตรวจวนิ ิจฉัย Trypanosomiasis ในตวั อย่างเลอื ด
วิธีการตรวจเบ้ืองตน้ ทาได้โดยการเจาะเลือดใส่ใน capillary tube แลว้ นาไปปั่นเช่นเดียวกบั การ

ปั่นฮีมาโตคริต จากน้นั นาหลอด capillary มาตรวจดูภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์ ที่กาลงั ขยาย 100-200 เท่า โดย
ตรวจดูการเคล่ือนไหวของเช้ือบริเวณช้ัน buffy coat ข้อสาคัญควรตรวจหลังจากป่ันภายใน 2-6 นาที
หลงั จากน้นั จะสังเกตเห็นไดย้ าก

การทาสเมียร์เลือด (Thin blood film) แล้วยอ้ มด้วยสี Giemsa เป็ นวิธียืนยนั ชนิดของเช้ือ โดย
cytoplasm จะติดสีน้าเงินฟ้ า nucleus หรือ kinetoplast จะติดสีม่วงแดง และสงั เกตเห็น flagella ของเช้ือ

การตรวจหาปรสิตในปัสสาวะและระบบสืบพนั ธ์ุ

การตรวจปัสสาวะ และส่ิงคดั หลง่ั จากระบบสืบพนั ธุ์มีวตั ถุประสงคเ์ พื่อหาปรสิตก่อโรคท่ีอาศยั อยู่
ในทางเดินปัสสาวะ และระบบสืบพนั ธุ์ ไดแ้ ก่ ไข่พยาธิ Schistosoma haematobium, Trichomonas vaginalis
และ ระยะ microfilaria ของพยาธิ Wuchereria bancrofti

การเกบ็ ปัสสาวะเพอื่ ส่งตรวจหาไข่พยาธิ Schistosoma haematobium
การเก็บปัสสาวะเพ่ือตรวจหาไข่พยาธิใบไมใ้ นกระแสโลหิตชนิด Schistosoma haematobium ควร

เก็บปัสสาวะในตอนกลางวนั ผูป้ ่ วยบางรายพบปัสสาวะเป็ นเลือด ซ่ึงไข่พยาธิมกั จะออกปนมากบั ลิ่มเลือด
ในช่วงสุดทา้ ยของการถ่ายปัสสาวะ ควรเก็บปัสสาวะเม่ือผปู้ ่ วยถ่ายใกลเ้ สร็จมาประมาณ 10 มิลลิลิตร ใส่ใน
ภาชนะท่ีสะอาด ปิ ดฝามิดชิด และส่งตรวจทนั ที

การตรวจหาไข่พยาธิ Schistosoma haematobium
เทปัสสาวะใส่ในหลอดทดลอง แลว้ นาไปปั่นที่ 1,500 rpm นาน 1-2 นาที นาตะกอนท่ีไดม้ าตรวจหา

ไข่พยาธิภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์ หากไดป้ ัสสาวะมาปริมาณมาก ให้เทปัสสาวะท้งั หมดใส่แกว้ เบียร์กน้ แคบ
แลว้ ต้งั ทิ้งไวน้ านประมาณ 30 นาที จากน้นั ค่อยๆเทส่วนบนทิ้ง ให้เหลือปัสสาวะประมาณ 10-15 มิลลิลิตร
แลว้ นามาป่ันเพอ่ื นาตะกอนมาตรวจ

25

การตรวจหาพยาธิ Wuchereria bancrofti
ผูป้ ่ วยจะมีปัสสาวะปนไขมนั โดยนาปัสสาวะมาปั่น แลว้ ตรวจตะกอนเช่นเดียวกบั การตรวจหา

พยาธิใบไมโ้ ลหิต จะพบพยาธิระยะ microfilaria ในปัสสาวะ

การเกบ็ ส่ิงคดั หลงั่ จากระบบสืบพนั ธ์ุ
ส่ิงคดั หลั่งจากระบบสืบพนั ธุ์ เช่น ตกขาว (vaginal discharge), urethral discharge และ prostatic

secretions ใช้ในการตรวจหาเช้ือ Trichomonas vaginalis โดยใช้ swab ป้ ายตัวอย่างตรวจ แล้วเก็บใส่
หลอดแกว้ ท่ีมีน้าเกลือ 1-2 มิลลิลิตร นาส่งหอ้ งปฏิบตั ิการทนั ที

การตรวจหาเชื้อ Trichomonas vaginalis
การตรวจทาไดโ้ ดย หยดน้าเกลือท่ีผสมสิ่งส่งตรวจลงบนสไลด์ ปิ ดทบั ดว้ ยกระจกปิ ดสไลด์แลว้

ตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์กาลงั ขยายต่าก่อน แลว้ จึงค่อยเพ่ิมกาลงั ขยายเพ่ือยืนยนั ชนิดเช้ือ โดยจะพบการ
เคลื่อนไหวของเช้ือแบบกระตุก (jerky movement)

การตรวจหาปรสิตในเสมหะ

ปรสิ ตบางชนิดสามารถตรวจพบได้ในเสมหะ เช่น ตัวอ่อนของพยาธิ Ascaris lumbricoides,
Strongyloides stercoralis, Hookworm ไข่ของพยาธิใบไม้ไม้ปอด Paragonimus westermani โปรโตซัว
Entamoeba histolytica และ Pneumocystis jiroveccii

การเกบ็ เสมหะและการส่งตรวจ
การเก็บตวั อย่างเสมหะควรเก็บตอนเช้าหลงั จากต่ืนนอน ให้ผูป้ ่ วยบ้วนปากด้วยน้ายาบ้วนปาก

(hydrogen peroxidase) ก่อนเพ่ือเป็ นการทาความสะอาดและลดการปนเป้ื อนของเช้ือในช่องปาก จากน้นั เก็บ
เสมหะที่ขบั ออกมาจากหลอดลม โดยเก็บในภาชนะท่ีสะอาดและมีฝาปิ ดมิดชิด ระวงั ไม่ใหน้ ้าลายปนออกมา
หากพบส่วนที่ผดิ ปกติ เช่น มีเลือดปน หรือมีสีสนิมใหเ้ ก็บมาดว้ ย เม่ือเก็บเสร็จแลว้ ควรนาส่งหอ้ งปฏิบตั ิการ
ทนั ที ไมค่ วรนานเกิน 1 ชวั่ โมง เพราะจะทาให้ปรสิตระยะ trophozoite ตาย หากไม่สามารถส่งตรวจไดท้ นั ที
อาจเกบ็ ไวใ้ นตเู้ ยน็ ท่ี 4 องศาเซลเซียส ไดไ้ ม่เกิน 12 ชว่ั โมง

การตรวจเสมหะหาไข่พยาธิใบไม้ในปอด
ผสมเสมหะกบั 3% NaOH ในอตั ราส่วน 1:1 ต้งั ทิง้ ไวท้ ่ีอุณหภูมิหอ้ ง 30 นาที จากน้นั เทใส่หลอดป่ัน

และปั่นที่ความเร็วรอบ 1,500 rpm นาน 10 นาที และเอาตะกอนมาตรวจ

26

การตรวจหาเชื้อ Entamoeba histolytica ระยะ trophozoite
การตรวจเสมหะเพื่อหาเช้ือ E. histolytica ควรตรวจแบบ wet smear โดยผสมกบั น้าเกลือบนสไลด์

แลว้ ปิ ดทบั ดว้ ย cover slip ไม่ตอ้ งผสมเสมหะกบั NaOH เน่ืองจากจะไปทาลายเช้ือระยะ trophozoite

การตรวจเสมหะหาเชื้อ Pneumocystis jiroveccii
การตรวจเสมหะเพ่ือหาเช้ือ Pneumocystis jiroveccii ในผปู้ ่ วยโรคเอดส์น้นั จะตอ้ งทาการกระตุน้ ให้

ผูป้ ่ วยไอเอาเสมหะออกมา เน่ืองจากเสมหะทวั่ ไปน้นั มีความไวต่า หรือตรวจจาก Bronchoalveolar lavage
จะทาให้มีโอกาสพบเช้ือได้มาก การตรวจทาได้โดยยอ้ มสิ่งส่งตรวจด้วยสี Gomori’s methenamine silver
(GMS) จะพบ cyst มีรูปร่างกลม ผนังด้านหน่ึงยุบ มีลักษณะคล้ายถ้วยคว่า หากยอ้ มส่ิงส่งตรวจด้วยสี
Giemsa จะเห็น intracystic body ติดสีเรียงอยภู่ ายใน cyst แต่ผนงั cyst ยอ้ มไมต่ ิดสี

การตรวจหาปรสิตในนา้ ไขสันหลงั

การตรวจน้าไขสนั หลงั ในทางปรสิตวทิ ยาน้นั มีวตั ถุประสงคเ์ พื่อตรวจหาติดเช้ือ free-living amoeba
ไ ด้ แ ก่ Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp. แ ล ะ ก า ร ติ ด เช้ื อ พ ย า ธิ Gnathostoma spinigerum,
Angiostrongylus cantonensis

วิธีการตรวจหาเช้ือโปรโตซัวน้นั ทาได้โดยตรวจดูสดๆ หรือตะกอนที่ไดจ้ ากการปั่นภายใตก้ ลอ้ ง
จุลทรรศน์ จะพบเช้ือระยะ trophozoite เคลื่อนที่ โดย Naegleria fowleri มีการเคล่ือนท่ีเร็ว เช้ือจะยื่น
pseudopod ไปทิศทางเดียว แต่ Acanthamoeba sp.จะมี pseudopod หลายทิศทาง

สาหรับพยาธิตวั จี๊ด Gnathostoma spinigerum มกั จะไม่ค่อยพบ เนื่องจากพยาธิมีขนาดใหญ่ แต่บาง
กรณี อาจพบได้ โดยพยาธิ ระยะ L3 จะพบหัวเป็ นกระเปาะและมีหนามเรี ยง 4 แถว ส่ วนพยาธิ
Angiostrongylus cantonensis น้ัน อาจพบได้ โดยจะพบตวั อ่อนพยาธิระยะ L4 มีลักษณะเรียวยาวคล้าย
เส้นดา้ ย

การตรวจหาปรสิตจากผวิ หนัง

ปรสิตที่มกั พบพยาธิสภาพท่ีผิวหนังท่ีสาคญั ในประเทศไทย ได้แก่ Leishmania การเก็บตวั อย่าง
ตรวจทาไดโ้ ดยการขูดผิวหนัง (skin scrap) บริเวณขอบแผลด้วยใบมีด แลว้ นามาทาสเมียร์บนสไลด์ ยอ้ ม
ดว้ ยสี Giemsa จะพบเช้ือระยะ amastigote เมื่อตรวจดูภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศน์

ภาคผนวก

Table 1 Show parasites that are commonly found in specimens or organ of human

Specimens or organs Type of Parasites Parasites Stage of parasites
Entamoeba histolytica trophozoites & cysts
Stool Protozoa Entamoeba coli trophozoites & cysts
Endolimax nana trophozoites & cysts
Helminthes Iodamoeba butschlii trophozoites & cysts
Blastocystis hominis cysts (vacuolar form)
Urine Protozoa Giardia lamblia trophozoites & cysts
Trichomonas hominis trophozoites & cysts
Helminthes Chilomastix mesnili trophozoites & cysts
Dientamoeba fragilis trophozoites
sputum/bronchoalveolar Protozoa Balantidium coli trophozoites & cysts
lavage Isospora belli oocysts
Cryptosporidium pavum oocysts
Helminth Sarcocystis sp. oocysts
Cyclospora cayetanensis oocysts
Microsporidia spores
Ascaris lumbricoides eggs
Hookworm eggs
Trichuris trichiura eggs
Strongyloides stercoralis larvae
Capillaria philippinensis eggs & adults
Fasciolopsis buski eggs
Echinostoma sp. eggs
Minute Intestinal Fluke eggs
Opisthorchis viverrini eggs
Paragonimus sp. eggs
Schistosoma japonicum eggs
Schistosoma mansoni eggs
Schistosoma mekongi eggs
Fasciola hepatica eggs
Dicrocoelium dendriticum eggs
Taenia saginata eggs & proglottids
Taenia solium eggs & proglottids
Hymenolepis nana eggs & proglottids
Hymenolepis diminuta eggs & proglottids
Diphyllobothrium latum eggs
Trichomonas vaginalis trophozoites
Microsporidia spore
Schistosoma haematobium eggs
Pneumocytis jirovecii trophozoites & cysts

Paragonimus sp. eggs
Strongyloides stercoralis larvae

28

Specimens or organs Type of Parasites Parasites Stage of parasites
Blood Protozoa Plasmodium sp. erythrocytic stages
Trypanosoma sp. trypomastigotes
Bone marrow/spleen Helminthes Wuchereria bancrofti microfilaria
Skin scraping Brugia malayi microfilaria
Muscle Protozoa Leishmania sp. amastigotes
Cerebrospinal fluid Protozoa Leishmania sp. amastigotes
Helminthes Onchocerca volvulus microfilaria
Helminthes Trichinella sp. larvae
Helminthes Angiostrongylus cantonensis larvae

การเตรียมสารเคมสี าหรับตรวจวนิ ิจฉัยทางปรสิตวทิ ยา

Cellophane staining solution

Glycerine 100 ml

3% aqueous malachite green 1 ml

Distill water 100 ml

Buffer methylene blue

Methylene blue 0.5 g

Acetate buffer pH 3.6 50 ml

Distill water 50 ml

เตรียม Acetate buffer โดยผสม 1.2% acetic acid 46.3 ml กบั 1.6% sodium acetate 3.7 ml

10% Formalin

40% Formaldehyde 1 ส่วน

Distill water 9 ส่วน

5% Lugol’s Iodine

Iodine 5 g

Potassium iodine 10 g

Distill water 100 ml

กรองเกบ็ ไวใ้ นขวดสีชา เม่ือใชง้ านใหผ้ สมน้ายา 1 ส่วน ต่อน้ากลนั่ 5 ส่วน อายใุ ชง้ าน 10 วนั

Merthiolate-Iodine-Formalin (MIF)

Lugol’s iodine 1.25 ส่วน

40% Formaldehyde 1.25 ส่วน

29

Merthiolate 7.50 ส่วน

Polyvinyl alcohol (PVA)

Schaudinn’s solution (without acetic) 93.4 ml

Glacial acetic acid 5.0 ml

Glycerine 1.5 ml

แช่ในน้าร้อน 75 องศา คอ่ ยๆใส่ผง PVA ปริมาณ 5 กรัม ลงไป คนดว้ ยแท่งแกว้ จนละลายหมด

น้ายาเมื่อเยน็ ตวั จะหนืดเลก็ นอ้ ย เกบ็ ไวไ้ ดน้ าน

Schaudinn’s fixative

Saturated mercuric chloride 200 ml

95% Ethyl alcohol 100 ml

ก่อนใชเ้ ติม Glacial acetic acid 15 ml

Alcohol-Iodine

หยด Lugol’s Iodine ลงใน 70% alcohol จนมีสีชาอ่อน

นา้ เกลอื อม่ิ ตวั ถพ. 1.200

NaCl หรือเกลือแกง 400 g

Distill water 1,000 ml

10% Giemsa stain

Giemsa stain 1 ส่วน

Phosphate buffer pH 7.2 9 ส่วน

Phosphate buffer = NaH2PO4.H20 2.05 กรัม + Na2HPO4 9.55 กรัม + NaCl 70.13 กรัม + Distill
water 800 ml

30

บรรณานุกรม

1. คณาจารย์ภาควิชาปรสิ ตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่. การตรวจทาง
หอ้ งปฏิบตั ิการปรสิตวทิ ยาทางการแพทย.์ เชียงใหม่. 2550

2. นิศารัตน์ โอภาสเกียรติคุณ, วฒั นาเล้ียวฒั นา, ดาราวรรณ วนะชิวนาวิน, มงคล คุณากร, วนิดา
วงศถ์ ิรพร. พยาธิวทิ ยาคลินิก. โรงพมิ พเ์ รือนแกว้ . กรุงเทพฯ. 2545.

3. ศูนย์อ้างอิงทางห้องปฏิบตั ิการโรคติดต่อนาโดยแมลง. คู่มือการตรวจวินิจฉัยเช้ือมาลาเรียทาง
หอ้ งปฏิบตั ิการ. สานกั โรคติดต่อนาโดยแมลง กรมควบคุมโรค. 2552

4. Garcia LS, Ash LR. Diagnostic Parasitology : clinical laboratory manual. 2nd ed. The C.V.
Mosby company. USA. 1979.

5. Markell EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. 7th ed. W.B.Saunders company. Mexico.
1992.

6. Sun T, Parasitic Disorders : pathology, diagnosis, and management. 2nd ed. Williams & Wilkins.
USA. 1999.

7. World Health Organization. Basic Laboratory methods in medical Parasitology. England. 1997.