PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAHMADA YOGYAKARTA 2002
1 TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI 1. Sebelum praktikum mulai mahasiswa diwajibkan untuk mempersiapkan : a. Mempersiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk praktikum. Khusus untuk alat-alat yang steril, mahasiswa diharuskan untuk mempersiapkan maksimal 2 (dua) hari sebelum praktikum agar dapat disterilisasi oleh laboran sehari sebelum praktikum. b. Membuat rencana kerja praktikum yang akan dikerjakan pada hari itu. c. Menyelesaikan tugas yang berhubungan dengan acara praktikum. d. Menempuh pretes yang dilaksanakan sebelum praktikum dimulai 2. Setelah selesai menjalankan praktikum, alat-alat harus dikembalikan dalam keadaan bersih dan kering. Untuk alat-alat bekas mikroba sebelum dibersihkan harus disterilkan terlebih dahulu. 3. Bila berhalangan hadir diwajibkan memberi keterangan resmi. 4. Laporan praktikum diserahkan setelah tiap acara praktikum selesai dengan format laporan yang disediakan. 5. Selama bekerja di laboratorium diharuskan untuk: a. Mencuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. b. Membersihkan meja praktikum dan kotak aseptis dengan desinfektan sebelum dan sesudah bekerja. c. Memakai jas praktikum yang bersih
2 d. Memberi label terhadap semua barang terutama yang disimpan dan diinkubasi. (Nama, No. mhs, gol, tanggal, jenis kultur dan keterangan lain yang dianggap penting). 6. Bagi mahasiswa yang tidak berhasil mendapatkan data selama praktikum diharuskan inhal dengan ketentuan yang akan ditetapkan kemudian. 7. Bagi mahasiswa yang terlambat lebih dari 15 menit tidak diperbolehkan ikut praktikum dan diharuskan inhal. 8. Setiap pelanggaran terhadap tata tertib akan dikenakan sangsi.
3 JADWAL ACARA PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI WAKTU ACARA PRAKTIKUM Minggu I 1. Praktikum 1 2. Praktikum 2 Minggu II Praktikum 3 Praktikum 4 Praktikum 5 tahap I Minggu III Praktikum 5 tahap II Praktikum 6 Praktikum 7 Minggu IV Praktikum 5 tahap III Praktikum 8 Praktikum 9 Minggu IV Praktikum 9 Praktikum 10 Keterangan : 1. Pretes umum dilakukan sebelum kegiatan praktikum dimulai (periode I dan II) 2. Sebelum mulai praktikum mahasiswa wajib menyerahkan tugas (PR, laporan dan rencana kerja) kepada assisten jaga. 3. Setiap akan dimulai praktikum dilakukan tes dengan topik praktikum pada hari tersebut 4. Praktikum dikerjakan berdasarkan urutan nomor 5. Praktikum 8 dan 9 dikerjakan oleh 3 kelompok 6. Responsi praktikum dilakukan sacara tertulis pada akhir praktikum 7. Nilai praktikum meliputi • Pretes (umum dan tes mingguan) • Presensi • Laporan sementara • Pekerjaan dan hasil praktikum • Laporan resmi • Responsi
4 PRAKTIKUM I PENGENALAN MIKROBA PENGAMATAN BAKTERI, JAMUR DAN YEAST Tujuan : - Melihat morfologi sel dan koloni bakteri Bacillus subtilis, Streptococcus sp, Staphylococcus aureus, Vibrio sp, dan Escherichia coli. - melihat morfologi sel jamur dan yeast - melihat morfologi koloni jamur dan yeast A. PENGAMATAN BAKTERI Bakteri dapat didefinisikan baik secara morfologi, biokimiawi maupun secara genetik. Identifikasi bakteri secara morfologi yaitu dengan mempelajari bentuk, ukuran dan susunan sel. Perubahan lingkungan mungkin dapat sedikit mempengaruhi bentuk dan ukuran sel, misalnya bakteri berbentuk batang dapat menjadi lebih pendek atau lebih panjang, namun hampir tidak pernah terjadi perubahan dari bentuk batang menjadi bentuk bulat atau sebaliknya. Sebagaian besar bakteri berbentuk silinder atau bulat. Bakteri silinder dapat berbentuk lurus atau lengkung. Bentuk silinder lurus itu disebut rod (batang) yang bervariasi dari panjang tipis hingga pendek tebal. Bentuk silinder lengkung juga bervariasi, pendek dan sedikit lengkung menyerupai koma sampai spiral panjang. Disamping itu bakteri berbentuk batang juga bervariasi dalam tingkat keeratannya satu sama lain setelah pembelahan sel. Hal ini menentukan apakah selnya berupa sel tunggal, berpasangan atau merupakan rantai panjang. Pada bakteri berbentuk bulat atau coccus, sel-selnya dapat tampak berpasangan (Diplococcus), rantai panjang (Streptococcus), berbentuk bujur sangkar (tetracoccus), berbentuk kubus (Sarcina)atau tidak beraturan menyerupai buah anggur (Staphylococcus). Susunan sel ini tidak sestabil bentuk sel karena susunan sel dapat berubah selama penanganan dan preparasi sampel untuk pengamatan mikroskop.
5 Gambar 1.1. Beberapa bentuk dan susunan sel bakteri. Tabel 1.1. Beberapa kenampakan koloni yang sering dijumpai
6 B. PENGAMATAN JAMUR DAN YEAST 1. MORFOLOGI JAMUR Jamur adalah organisme multiseluler yang berfilamen dan pertumbuhannya mudah dilihat karena penampakannya yang berserabut seperti kapas. Jamur terdiri dari suatu thalus yang tersusun dari filamen yang bercabang yang disebut hifa. Kumpulan dari hifa disebut miselium. Hifa jamur dapat bersekat (disebut dengan septa) dan dapat pula tidak bersekat (konositik). Jamur dengan hifa bersekat termasuk dalam kelas Ascomycetes, Basidiomycetes dan Deuteromycetes. Sedangkan jamur yang konositik termasuk dalam kelas Phycomycetes. Umumnya hifa jamur tidak berwarna (transparan). Miselia mungkin memiliki bentuk spesifik, sehingga dapat dipakai dalam identifikasi, misalnya : rhizoid pada Rhizoid sp, sel kaki pada Aspergillus sp atau percabangan bentuk Y pada Geotrichum sp. Pada miselium vegetatif yang timbul di atas permukaan dapat ditemukan spora. Dalam pengamatan morfologi jamur dengan mikroskop yang perlu diamati adalah : 1. Hifa : bersepta atau tidak, transparan atau keruh, berwarna atau tidak. 2. Spora seksual : oospora, askospora, basidiospora atau bentuk lainnya. 3. Spora aseksual: sporangiospora, konidiospora, arthrospora. 4. Badan buah : sprongium, bentuk, warna, letak, ukuran. Apabila menghasilkan konidia, perlu ditentukan tipe konidianya. 5. Dasar badan buah : berupa kolumela, vesikula. Perlu ditentukan bentuk dan ukurannya. 6. Pendukung badan buah : tunggal atau dalam bentuk berkas, bercabang atau tidak. 7. Bentuk-bentuk khusus, misal : stolon, rhizoid, sel kaki, apofisa, klamidospora dan lain-lain.
7 Gambar 3.1. Tipe percabangan konidiofora : (a&b) monoversilata © biversilata (d) terversilata (e) quaterversilata. 2. MORFOLOGI YEAST Yeast merupakan fungi uniseluler dan berkembang biak dengan tunas (budding), pembelahan sel, spora aseksual maupun seksual. Yeast yang berkembang biak secara aseksual termasuk dalam fungsi imperfecti sedangkan yang membentuk spora seksual digolongkan ke dalam Ascomycetes dan Basidiomyetes. Ukuran sel yeast lebih besar dari sel bakteri (+ 1-9 x 2-50). Bentuk sel yeast bermacam-macam, ada yang berbentuk botol atau membentuk miselium semu (pseudomiselium). Mikro struktur sel yeast terdiri atas kapsul dinding sel, membran sitoplasma, nukleus, vakuola, mitokondria, globula lipida dan sitoplasma.
8 Bahan dan alat yang digunakan : 1. Preparat awetan dan biakan murni Bacillus subtilis, Streptococcus sp, Staphylococcus aureus, Vibrio sp, dan Escherichia coli. 2. Preparat awetan dan biakan murni jamur : Aspergillus sp, Rhizopus sp 3. Preparat awetan dan biakan murni yeast: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae 4. Mikroskop cahaya 5. Minyak emersi Cara kerja : 1. Amati bentuk-bentuk sel bakteri, jamur dan yeast pada preparat awetan yang telah disediakan dengan menggunakan mikroskop, mulailah dengan perbesaran lemah dan dilanjutkan dengan perbesaran sedang hingga kuat (menggunakan minyak imersi). 2. Amati kenampakan koloni pada biakan murni bakteri, jamur dan yeast. 3. Buatlah gambar sel dilengkapi dengan keterangan yang diperlukan (nama , bentuk dan ukuran sel, hifa, spora dan lain-lain dan beri keterangan yang diperlukan (nama preparat, perbesaran yang dipakai, dan lain-lain) 4. Bersihkan minyak imersi pada lensa dengan menggunakan larutan xylol.
9 PRAKTIKUM II TEKNIK PENGECATAN Tujuan Praktikum : Menentukan Gram positif atau Gram negatif bakteri uji dan jamur uji TEKNIK PENGECATAN Kebanyakan sel-sel mikrobia tidak mudah diamati dibawah mikroskop karena selsel mikrobia tidak berwarna (transparan) sehingga sulit diamati dengan teliti. Dengan teknik pengecatan dapat diperoleh perbedaan warna antara sel mikrobia dengan latar belakangnya sehingga sel-sel mikrobia dapat diamati dengan lebih jelas. Larutan perwarna tidak dapat terserap oleh sel mikrobia hidup, sehingga sebelum dilakukan pewarnaan, mikrobia umumnya dicatkan terlebih dahulu. Sel mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Reaksi kimia terjadi antara pewarna dan komponen-komponen di dalam sel, sehingga warna tetap tertinggal meskipun sel dicuci dengan air. Pada dasarnya ada 3 tipe pengecetan sel bakteri yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan khusus. Pengecatan sederhana adalah pengecatan sel mikrobia dengan satu pewarna dan satu tahap pengecatan saja. Tipe pengecatan ini dapat mewarnai sel atau latar belakangnya sehingga memungkinkan untuk mengamati bentuk sel dan susunan sel. Contoh : karbol fuschin, gentian violet, metylen blue Pengecatan diferensial/majemuk merupakan pengecatan sel mikrobia yang menggunakan kombinasi pewarna. Pengecatan ini dapat digunakan untuk identifikasi karena masing-masing mikrobia mempunyai reaksi tertentu. Contoh : pengecatan Gram, ZN/acid fast atau tahan asam Pengecatan khusus merupakan pengecatan yang hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat digunakan untuk membedakan bagian yang satu dengan bagian yang lain
10 dari bakteri. Sebagai contoh antara lain adalah pengecatan Gram untuk melihat flagella (flagella akan terlihat berwarna merah) dan pengecatan Burri untuk melihat kapsula (kapsula akan terlihat jernih dan badan bakteri dan sekitarnya berwarna hitam) Pada jamur, pengamatan mikroskopik dapat dilakukan dengan preparat natif (tanpa pengecatan) yaitu dengan menggunakan larutan garam fisiologis atau KOH 10- 20% ataupun dengan pengecatan. Seperti halnya pada bakteri, dikenal tiga tipe pengecatan untuk pengamatan mikroskopik jamur yaitu pengecatan sederhana dengan lactophenol (LP) yang berwarna cokelat muda maupun lactophenol Cotton blue (LCPB) yang berwarna biru; pengecatan diferensial, sebagai contoh pengecatan Gram dimana semua jamur akan tercat Gram positif, pengecatan ZN dimana semua jamur akan tercat ZN negatif kecuali Nocardia sp, cat Gammormethanomny Silver Nitrat (GMS) yang akan memberi warna hitam pada jamur dan hijau pada latar belakangnya, cat Periodic Acid Shift (PAS) dimana jamur akan berwarna merah dan kontrasnya berwarna kuning/hijau muda dan cat modifikasi Brown Brenn dimana jamur akan bertambah coklat dan kontras/latar belakangnya akan berwarna kuning; dan pengecatan special, seperti misalnya tinta cina untuk pengamatan kapsula yang akan menyebabkan kapsula menjadi mengkilat dengan dasar hitam dan mucicarmine yang menyebabkan kapsula berwarna merah. Pengecatan yang lain yaitu HE dan GIEMSA digunakan untuk pemeriksaan jaringan. Pengecatan sel yeast pada pengamatan sel yeast secara mikroskopik pada dasarnya serupa dengan pengecatan pada bakteri dan jamur. Pada yeast dikenal pula pengecatan sederhana dan pengecatan khusus seperti halnya untuk tujuan pengamatan spora yeast, pengamatan globula lemak dan lain-lain. Contoh pewarna yang digunakan untuk melihat struktur sel yeast antara lain adalah anilin untuk melihat seluruh sel, besi hematoksilin untuk melihat nukleus, merah sudan untuk melihat globula lemak, kalium iodida untuk melihat granula pati dan glikogen dan tinta india untuk melihat kapsula.
11 Bahan dan Alat yang digunakan : 1. Biakan murni bakteri : Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus. 2. Biakan murni jamur : Aspergillus sp, Rhizopus sp 3. Larutan cat Gram. Cat Gram A : kristal violet 2 gr (warna ungu) Alkohol 96 % 20 ml Ammonium oxalat 1 % in aqua 80 ml. Cat Gram B : Jodium 1 gr (warna cokelat) Kalium Jodid (KJ) 2 gr Aquadest 800 ml (larutan KJ dalam air, kemudian ditambahkan Jodium. Simpan dalam botol warna cokelat). Cat Gram C : Aceton 30 ml (tidak berwarna) Alkohol 96 % 70 ml Cat Gram D : Safranin 1 gram (warna merah) Alkohol 96 % 10 ml. Aquadest 90 ml . Cara kerja : 1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama mikrobia yang akan di cat. Di bawah gelas benda digambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol, gunakan daerah ini untuk pengecatan mikrobia. Balikan gelas benda sehingga gambar bulatan ada dibaliknya. 2. Letakkan 1 tetes aquadest pada permukaan gelas benda dalam daerah yang sudah digambar. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara aseptis dan campur dengan aquadast pada gelas benda. Ratakan suspensi ini pada seluruh area bulatan. 3. Kering anginkan sehingga membentuk noda. 4. Lakukan fiksasi panas dengan melewatkan gelas benda pada nyala api beberapa kali (jangan sampai gelas benda terkena api secara langsung sehingga menjadi terlalu panas). 5. Genangi preparat dengan cat Gram A selama 1 –3 menit. Buang cat tanpa dicuci dengan air. 6. Genangi preparat dengan cat Gram B selama 1 menit. Cuci sisa cat Gram B dengan air mengalir dan kering anginkan.
12 7. Miringkan gelas benda dan cuci dengan cat Gram C dengan cara meneteskannya pada permukaan noda sampai warna cat tepat dilunturkan (tidak berwarna) + selama 30 detik. 8. Cuci dengan air mengalir secara singkat dan kering anginkan. 9. Genangi preparat dengan cat Gram D dan diamkan selama 2 menit. Cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. 10. Tutup permukaan gelas benda dengan gelas penutup dan amati dibawah mikroskop dengan pembesaran kuat dengan minyak imersi. Sel berwarna merah muda merupakan Gram negatif dan sel berwarna biru ungu merupakan Gram positif. 11. Catat hasil pengamatan, Gambar beberapa sel yang mewakili dan tulis perbesaran yang dipakai.
13 PRAKTIKUM III STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA Tujuan praktikum : - Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja mikrobiologi - Melakukan sterilisasi dengan autoklaf Pendahuluan Medium untuk pertumbuhan mikrobia harus mengandung nutrisi dasar yaitu: sumber karbon (C), sumber nitrogen (N), mineral (P, Mg, Ca, Na) dan vitamin. Berdasarkan komposisinya medium dapat digolongkan menjadi medium sintetik dan medium kompleks. Untuk kegiatan rutin laboratorium biasanya digunakan medium kompleks yang mampu menyediakan nutrisi kompleks yang diperlukan mikrobia. Salah satu contoh medium komplek adalah nutrien agar yang mengandun pepton dan beef ekstrak. Pepton mengandung sedikit karbohidrat, vitamin dan macam-macam asam amino dengan prosentase tergantung pada asal peptonnya. Beef ekstrak adalah ekstrak daging yang kaya akan nutrisi. Selain berfungsi untuk kultivasi mikrobia, media juga berfungsi untuk menyeleksi mikrobia tertentu dan melakukan pengukuran kuantitatif suatu antibiotik atau vitamin. Berdasarkan struktur fisiknya media dapat dikelompokkan menjadi medium cair, padat dan setengah padat. Untuk membuat medium padat biasanya digunakan agar yang memadat pada suhu sekitar 400C. Proses sterilisasi diperlukan untuk menghilangkan mikrobia pada bahan dan alat yang akan digunakan dalam kerja mikobiologi. Ada beberapa macam metode sterilisasi. Pemilihan metode antara lain tergantung pada apa yang akan disterilisasi dan sifat bahan yang akan disterilisasi..
14 Bahan dan alat yang dipergunakan: a. Alat • Tabung reaksi • Labu erlenmeyer • Beker glass • Pipet tetes • Gelas ukur • pH meter • Autoklaf b. Bahan • Agar • Berbagai macam media Cara kerja: a. Penyiapan alat-alat Alat-alat yang akan digunakan untuk kerja steril disiapkan dengan cara sebagai berikut: tabung reaksi, labu erlenmeyer ditutup dengan kapas berbalut kassa dan alumunium foil atau kertas payung, piring petri, pinset, blue tip, yellow tip dibungkus dengan kertas payung. Alat-alat tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 30 menit. Setelah alat-alat disterilisasi kemudian dikeringkan dalam oven. b. Pembuatan media Medium yang akan digunakan dibuat dengan cara sebagai berikut: 1. Timbang masing-masing medium sesuai kebutuhan dan ketentuan yang tertera pada label medium. 2. Larutan medium tersebut dalam sebagaian akuades 3. pH medium diatur sesuai dengan yang dikehendaki dengan menambahkan HCl atau NaOH.
15 4. Setelah pHnya sesuai dilarutkan dengan sisa akuades, kemudian dibagi-bagi dalam wadah yang sesuai (tabung reaksi, labu erlenmeyer) 5. Tutup wadah medium dengan kapas berbalut kasa kemudian alumunium foil. 6. Sterilisasi dalam autoklaf pada 1210C selama 15 menit. 7. Untuk membuat medium pada ditambahkan agar sebanyak 1,5 – 2% (b/v) 8. Medium yang tidak langsung digunakan disimpan dalam refrigerator. 9. Untuk membuat medium agar miring, segera setelah sterilisasi selesai medium dimiringkan dengan kemiringan yang sesuai dan dibiarkan memadat.
16 PRAKTIKUM IV TEKNIK ASEPTIS : PEMINDAH BIAKAN I. TUJUAN : - Memindahkan biakan dari satu media ke media lain - Mampu melakukan kerja aseptis II. PENDAHULUAN Biakan murni (pure culture) sangat diperlukan dalam kegiatan mikrobiologi, misalnya untuk keperluan diagnostik, karakterisasi mikroorganisme, industri mikrobiologi dan lain-lain. Untuk mendapatkan kultur yang murni selain nutrisi dan lingkungan yang menunjang pertumbuhan mikroorganisme tersebut juga perlu dicegah adanya kontaminan dalam biakan. Untuk itu diperlukan suatu teknik aseptis. Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari satu tempat ke tempat lain. Dengan teknik aseptis seorang mikrobiologi berusaha mencegah terjadinya kontaminasi pada biakan. Teknik aseptis juga mencegah seorang mikrobiologis terkontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat patogen. Untuk menyempurnakan kerja aseptis, hal yang perlu diperhatikan adalah: (1) Area tempat kerja dibersihkan dengan desinfektan: (2). Alat-alat untuk keperluan kerja aseptis disterilisasi terlebih dahulu; (3). Pekerjaan dikerjakan secara cepat dan efisien III. BAHAN DAN ALAT Lampu spiritus Ose Nutrien agar miring Kaldu nutrien Kultur cair Kultur dalam agar miring Kultur yang akan ditanam adalah; Escherichia coli ATCC 25922 Aspergillus sp Bacillus subtilis ATCC 6633 Penicillium sp
17 IV. CARA KERJA 1. Pemindahan biakan dari media cair ke media pada Buka tabung yang berisi kultur yang akan dipindahkan, panasi mulut tabung dengan lampu spiritus. Masukkan pipet steril ke dalam biakan, ambil sedikit cairan Buka tabung berisi nutrien agar, panasi mulut tabung dengan lampu spiritus Pindahkan biakan dari pipet ke dalam tabung nutrien agar miring Panasi kembali mulut tabung, tutup dengan kapas berbalut kassa dan alumunium foil, panasi kembali tutupnya. Inkubasi pada 370C untuk praktikum yang akan datang. 2. Pemindahan biakan dari media padat ke media padat Buka tabung yang berisi kultur, panasi mulut tabung dengan lampu spiritus Panasi ose sampai merah. Ambil sedikit biakan dari agar miring, goreskan ke dalam tabung yang berisi media agar miring Panasi kembali mulut tabung, tutup dengan kapas berbalut kasa dan alumunium foil, panasi kembali tutupnya. Inkubasi pada 370 untuk praktikum yang akan datang.
18 PRAKTIKUM V SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH MIKROBIA PENGHASIL ANTIBIOTIK I. TUJUAN Setelah melakukan praktikum mahasiswa diharapkan 1. Mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi dan memurnikan baikan, malakukan test terhadap kemampuan biakan menghasilkan antibiotik) 2. Mendapatkan mikroorganisma yang menghasilkan antibiotik. II. PENDAHULUAN Saat ini mikrobia tidak hanya dipandang sebagai organisma yang merugikan manusia karena dapat menyebabkan penyakit, tetapi juga merupakan jasad yang dapat dimanfaatkan bagi kesejahtaraan umat manusia. Telah diketahui bahwa mikrobia dapat menghasilkan berbagai macam produk yang bermanfaat bagi manusia seperti enzim, asam amino, protein, vitamin dan antibiotik. Penemuan antibiotik penisilin oleh Alexander Fleming telah membuka era baru dalam pencarian obat yang berasal dari mikrobia. Mikrobia terseleksi yang dipergunakan dalam industri fermentasi dihasilkan dari proses skrining (penapisan). Skrining dilakukan untuk mendapatkan mikrobia yang potensial. Strain (galur) terpilih merupakan penghasil antibiotik harus menghasilkan metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan atau reproduksi mikrobia patogen tetapi tidak toksis terhadap inang. Hasil yang positif dari proses skrining primer masih harus mengalami penelitian lebih lanjut sampai menjadi antibiotik yang bisa dimanfaatkan. Mikrobia terdapat dimana-mana termasuk dalam tanah. Tanah merupakan sumber yang kaya akan mikrobia. Banyak mikrobia yang diisolasi dari tanah potensial menghasilkan antibiotik yang digunakan sekarang.
19 III. ALAT DAN BAHAN Tahap I • Petri (2)* • Tabung reaksi (3)* • Mikropipet dan yellow tip * (5) • Glass spreader • Media selektif (Czapex dox dan antibiotik) • Larutan salin • Sampel tanah Tahap II • Petri (2) • Ose bulat • • Labu Erlenmeyer 50 cc (2)* untuk wadah mensterilkan media • Media pertumbuhan (Czapex dox) Tahap III • Petri (2)* • Labu Erlemeyer 50 cc (2)* untuk wadah mensterilkan media • Pelubang gabus * • Ose jarum • Media TSA • Kultur mikrobia uji (Gram positif dan Gram negatif) dalam kaldu nutrien yang ditanam sehari.
20 IV. CARA KERJA Tahap I 1. Suspensikan 1 gram sampel tanah dengan 10 ml larutan saline dalam tabung steril. 2. Encerkan hingga konsetrasi 10-2 3. Tuang 0,5 ml suspensi tersebut dalam petri steril yang telah dituangi meida selektif padat (Czapex dox dengan ditambah antibiotik). Ratakan dengan menggunakan spreader glass. 4. Inkubasi pada suhu kamar, sampai praktikum berikutnya. Tahap II 1. Pilih salah satu koloni yang dominan, diambil dengan ose, tanam dalam media pertumbuhan (media sama no. 3 tanpa penambahan antibiotik) 2. Inkubasi pada suhu kamar, sampai praktikum berikutnya. Tahap III 1. Cairkan media kaldu nutrien yang telah disterilisasi, tunggu beberapa saat sampai tidak terlalu panas, campurkan dengan suspensi mikrobia uji, tuang ke dalam petri, tunggu beku. 2. Buat ‘plug’ (irisan) pada media pertumbuhan ke media kaldu nutrien. 3. Pindah koloni dari media pertumbuhan ke media kaldu nutrien 4. Inkubasi pada suhu 370 C 24 jam dan amati adanya hambatan pada daerah sekitar koloni. V. PERTANYAAN 1. Apa yang dimaksud dengan skrining primer dan apa bedanya dengan skrining sekunder ? 2. Data apa saja yang diperoleh selama proses skrining primer ?
21 PRAKTIKUM VI PENENTUAN KADAR ANTIBIOTIK I. TUJUAN Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar antibiotik dari suatu sampel. II. PENDAHULUAN Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan mikroba yang dalam jumlah kecil dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikrobia lain. Penentuan kadar antibiotik dari suatu sampel sangat diperlukan antara lain untuk memeriksa kadar antibiotik dalam suatu sediaan obat, kadar antibiotik dalam susu, daging, penetapan kadar antibiotik yang dihasilkan dari proses fermentasi dll. Penentuan kadar antibiotik dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, salah satu diantaranya dengan menggunakan metode difusi agar. Metode ini dilakukan dengan menanam mikrobia uji pada media agar yang sesuai, kemudian pada permukaan agar dibuat sumuran atau diberi disk atau silinder untuk menempatkan antibiotik yang diuji. Kadar antibiotik ditentukan dengan cara mengukur diameter hambatan pertumbuhan mikrobia uji yang ditandai dengan adanya daerah jernih disekeliling sumuran, disk atau cakram silinder kemudian diplotkan dengan kurva baku antibiotik. I. ALAT DAN BAHAN 1. Alat • Piring petri * (2) • Cakram silinder atau kertas shamir
22 • Pinset * • Mikropipet dan yellow tip * (5) • Jangka sorong • Gelas ukur 10 ml* (1) 2. Bahan • Sampel yang akan ditentukan kadarnya • Media antibiotik No. 1 • Larutan baku antibiotik • Suspensi bakteri uji dalam kaldu nutrien yang ditanam sehari sebelumnya. II. CARA KERJA 1. Cairkan media antibiotik No. 1 yang telah disterilkan, tunggu sampai suhunya kurang lebih 400 C, campurkan suspensi bakteri uji. 2. Tuang ke dalam piring petri steril masing-masing 10 ml, tunggu hingga beku. 3. Pasang cakram silinder di atas permukaan agar yang telah beku. 4. Teteskan sebanyak 10 l sampel yang diuji atau larutan baku ke dalam cakram silinder. 5. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 370 C. 6. Ukur diameter hambatan masing-masing (sampel standard) 7. Buat kurva baku antara log konsentrasi standard dengan diameter hambatan. 8. Tentukan kadar sampel dengan cara memplotkan dengan kurva baku. III. PERTANYAAN 1. Dalam metode difusi agar, disebut dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran potensi antibiotik ! 2. Sebut dan jelaskan metode lain untuk menetapkan potensi antibiotik !
23 PRAKTIKUM VI UJI SENSITIFITAS MIKROBIA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY-BAUER) I. TUJUAN : Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat : 1. Melakukan uji sensitifitas mikrobia terhadap antibiotik dengan metode Kirby-Bauer 2. Menentukan mikrobia uji termasuk sensitif atau resisten terhadap antibiotik yang diujikan. II. PENDAHULUAN Pada saat ini banyak sekali jenis antibiotik yang digunakan untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh mikrobia patogen. Antibiotik yang digunakan dalam medis bertujuan untuk mengeliminasi infeksi oleh mikrobia atau mencegah penyebaran infeksi. Antibiotik harus mampu menghambat atau membunuh mikrobia penyebab infeksi tetapi tetapi tidak toksis terhadap inangnya. Penentuan antibiotik yang cocok untuk mengobati infeksi tertentu sangat penting dalam klinik. Sangat tidak baik menggunakan antibiotik yang tidak efektif melawan mikrobia patogen. Metode Kirby-Bauer adalah metode yang digunakan untuk megetahui sensitivitas suatu mikrobia terhadap antibiotik tertentu. Diameter hambatan pertumbuhan mikrobia oleh antibiotik diukur dan diinterpretasikan dengan antibiogram.
24 III. ALAT DAN BAHAN A. Alat • Petri (2)* • Jangka sorong • Erlenmeyer 50 cc (2)* untuk wadah sterilisasi media B. Bahan • Media nutrien agar • Kultur mikrobia uji dalam kaldu nutrien : Eschericha coli dan Staphylococcus aureus yang ditanam sehari sebelumnya. • Bermacam-macam antibiotik • Paper disk IV. CARA KERJA 1. Siapkan dan sterilisasi 10 ml media kaldu nutrien dalam erlenmeyer 2. Setelah agak dingin campur dengan mikrobia uji, homogenkan. 3. Tuang dalam petri steril, tunggu hingga beku. 4. Pasang paper disk di atas permukaan agar. 5. Tetesi dengan 10 l larutan antibiotik. 6. Inkubasi pada 370 C selama 24 jam. 7. Ukur diameter hambatannya untuk masing-masing antibiotik dengan masing-masing mikrobia uji. 8. Interpretasikan hasil dengan antibiogram. V. PERTANYAAN 1. Apa pentingnya uji sentifitas antibiotik dalam klinik. 2. Apakah yang dimaksud dengan antibiogram
25 INTERPRETATION OF ZONE OF INHIBITION FOR KIRBY-BAUER ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY TESTING Disk Antibiotik conc. Resistent Intermediate Suscepcible Amikacin 0,01mg 13 or less 12-13 14 or more Ampicillin 0,01mg 11 or less 12-14 14 or more Bacitracin 10 units 8 or less 9-11 12 or more Cephalothin 0,03 mg 14 or less 15-17 18 or more Chloramphenicol 0,03 mg 12 or less 13-17 18 or more Erythromycin 0,016mg 13 or less 14-18 19 or more Genytamicin 0,01 mg Kanamycin 0,03 mg 13 or less 14-17 18 or more Lincomycin 0,002 mg 9 or less 10-14 15 or more Methicillin 0,005 mg 9 or less 10-13 14 or more Nalidixic acid 0,03 mg 13 or less 14-18 19 or more Neomycin 0,03 mg 12 or less 13-16 17 or more Nitrofurantoin 0,3 mg 14 or less 15-16 17 or more Penisilin G vs 10 units 20 or less 13-19 20 or more staphylococci Penicillin vs 10 units 11 or less 13-28 29 or more other organisms Polymyxin 300 units 8 or less 9-11 12 or more Streptomycin 0,01 mg 11 or less 13-16 17 or more Suifonarmides Tetracycline 0,03 mg 14 or less 15-18 19 or more Vancomycin 0,03 mg 9 or less 10-11 12 or more Inhibition zone diameter (mm)
26 PRAKTIKUM VIII UJI ANGKA LEMPENG TOTAL I. TUJUAN Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam sediaan makanan, minuman, kosmetika, obat dan obat tradisional. I. PENDAHULUAN Uji angka lempeng total merupakan metode yang umum digunakan untuk menghitung adanya bakteri yang terdapat dalam sediaan yang diperiksa. Uji angka lempeng total dapat dilakukan dengan dua teknik yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik sebaran (spread plate). Pada prinsipnya dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer. II. ALAT DAN BAHAN A. Alat • Petri * (7) • Tabung reaksi * (6) • Labu Erlenmeyer untuk wadah mensterilkan media • Blue Tip * (15) • Gelas ukur 10 ml * (1)
27 B. Bahan • Sampel yang diperiksa (serbuk jamu) • Medium Plate Count Agar (PCA) dan larutan fisiologis IV. CARA KERJA 1. Timbang 1 gram sampel yang akan diperiksa kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer. 2. Lakukan pengenceran sampai 10-5 . 3. Tuang sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran pada cawan petri. 4. Ke dalam setiap cawan petri tersebut dituangkan medium PCA ( suhu + 400 C) yang telah disterilkan. 5. Petri diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam dalam posisi terbalik. 6. Lakukan penghitungan koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri. Angka lempeng total dihitung dengan ketentuan seperti di bawah ini. Perhitungan: Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30 – 300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan petri dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut: • Bila hanya salah satu diantaranya kadua cawan petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah antara 30 – 300 koloni, dihitung rata-rata dari kedua cawan dikalikan dengan faktor pengenceran. • Bila pada cawan petri dari kedua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 30 – 300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengencer kemudian diambil angka rata-rata. Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati koloni yang lebih besar dua kali
28 jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah. • Bila dari seluruh cawan petri tidak satupun yang menunjukkan 30 – 300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai Angka Lempeng total perkiraan. • Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan petri dan bukan disebabkan karena inhibitor, maka Angka Lempeng total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan dengan faktor pengencer paling rendah. • Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 300, maka cawan dengan tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sektor (2,4 atau 8). Jumlah koloni dikalikan dengan faktor pembagi dan faktor pengencerannya. Hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Perkiraan. • Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka jumlah koloni adalah 200 x 8 x faktor pengenceran. Angka lempeng total perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh. Persyaratan : Jumlah angka lempeng total memenuhi aturan Departemen Kesehatan jika kurang dari 106 V. PERTANYAAN 1. Bagaimana metode cawan tuang dan sebaran dilakukan? Pada praktikum ini termasuk metode yang mana? 2. Jelaskan keuntungan dan kerugian kedua metode tersebut!
29 PRAKTIKUM IX UJI ANGKA KAPANG/KHAMIR I. TUJUAN Setelah mengikuti praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat menetapkan adanya cemaran kapang/khamir dalam sediaan makanan, minuman, kosmetika, dan obat tradisional. II. PENDAHULUAN Angka kapang/khamir menunjukkan adanya cemaran kapang/khamir dalam sediaan yang diperiksa. Setiap sediaan mensyaratkan batas angka kapang/khamir tertentu yang masih dianggap aman. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni 40-50 buah. Angka kapang/khamir dinyatakan sebagai jumlah koloni kapang/khamir hasil perhitungan dikalikan faktor pengenceran. III. ALAT DAN BAHAN A. Alat • Tabung reaksi (4)* • Petri (6)* • Blue tip * (10) • Gelas ukur 10 ml* (1) B. Bahan • Sampel yang diperiksa (serbuk jamu) • Medium PDA (Potato Dextrosa Agar) mengandung kloramfenikol 100 ml/l. • Medium ASA (Air Suling Agar 0,05%)
30 IV. CARA KERJA 1. Timbang 1 gram sampel yang akan diperiksa kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer (ASA) 2. Lakukan pengenceran sampai 10-4 . 3. Dari masing-masing pengenceran dipipet 0,5 ml kemudian dituangkan pada permukaan medium PDA, segera diratakan. Sebagai kontrol adalah medium PDA dan larutan pengencer. 4. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-250 C dan diamati pada hari ketiga sampai ke- 5. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Perhitungan : Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 40-60. Jumlah koloni dari kedua cawan petri dihitung kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Bila pada dua cawan petri pada dua tingkat pengenceran dan berturutan menunjukkan jumlah antara 40-60, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran kemudian diambil rata-rata. Angka diambil dinyatakan sebagai angka kapang/khamir dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut: • Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah koloni antara 40-60 buah, dihitung dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran. • Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni labih besar dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah. • Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satu pun yang menunjukkan jumlah antara 40-60 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai angka kapang/khamir perkiraan.
31 • Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan faktor inhibitor, maka angka kapang/khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran. Persyaratan : Jumlah angka kapang memenuhi aturan Departemen Kesehatan jika kurang dari 104
32 PRAKTIKUM X UJI BIOAUTOGRAFI I. TUJUAN Pada akhir praktikum mahasiswa diharapkan dapat melakukan uji antibakteri dengan menggunakan metode bioautografi. II. PENDAHULUAN Bioautografi merupakan metode yang dapat digunakan untuk identifikasi komponen bioaktif termasuk polaritasnya. Metode ini dapat mendekatkan metode` separasi dengan uji biologi. Bentuk yang paling umum dari bioautografi adalah untuk mendeteksi adanya senyawa antimikrobial. Cara ini merupakan cara yang cukup efektif untuk mendeteksi adanya senyawa antimikrobial yang tidak diketahui dalam suatu ekstrak. III. ALAT DAN BAHAN A. Alat : 1. Seperangkat alat Kromatofrafi lapis tipis (KLT) 2. Petri *(2) 3. Gelas ukur 10 ml *(2) 4. Labu Erlenmeyer 50 cc (untuk sterilisasi media) *(1) 5. Pipet B. Bahan 1. Ekstrak rimpang Curcuma mangga (temu putih) 2. Lempeng KLT GF 254 3. Fase gerak heksana : etil asetat = 96 : 4 4. Media TSA
33 5. Staphylococcus aureus 6. Eschericia coli 7. Pereaksi semprot vanilin sulfat IV. CARA KERJA 1. Totolkan lebih kurang 15 l ekstrak diatas 3 lempeng KLT hingga kering. 2. Masukkan 3 lempeng KLT dalam bejana pengembangan yang telah berisi fase gerak jenuh. Elusi hingga jarak pengembangan lebih kurang 8,5 cm. 3. Keringkan hasil KLT hingga tidak berbau pelarut pengembang. 4. Catat harga Rf dan gambar bercak yang ada secara visual maupun dibawah lampu UV254 dan UV366 5. Letakkan dua lempeng diatas media yang telah diberi suspensi mikroba uji ( satu di Staphylococcus aureus lainnya di Eschericia coli) selama 20 menit kemudian diangkat. 6. Media pertumbuhan mikroba diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37C. 7. Sisa lempeng KLT disemprot dengan pereaksi semprot. 8. Amati perubahan warna pada kromatogram, zona hambatan yang terjadi dan tentukan harga Rf zona hambatan V. PERTANYAAN 1. Apa yang dimaksud dengan kromatografi? Berikan penjelasan singkat.
34 DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1994, Farmakope Indonesia, Edisi 4, Departemen Kesehatan RI. Anonim, 1992, Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi. Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan Departemen Kesehatan RI, 14-15, 21-25 Atlas, R.M., Brown, A.E., Dobra, K.W., and Lionas, M., 1989, Experimental Microbiology Fundamental & Aplication, MacMillan Publishing Company, New York. Bangun, A., 1989, Isolasi & Identifikasi, PAU Bioteknologi UGM, Yogyakarta. Browne, L.M. & Szenthe N.A., 1989, Laboratory Manual For Microbiology. 2 nd ed, Department of Chemistry University of Alberta, Canada. Gibbons, S. and Gray, A.I., 1998, Isolation by Planar Cromatography, Edited by Richard J.P Channel, Natural Product Isolation, Humana Press, New Jersey, 240- 241. Griffin, D.H., 1981, Fungal Physiology, John Wiley & Sons Inc., New York. Madingan, T.M., Martinko, J.M. and Parker, J. 1997. Biology of Microorganism. Ed.8. Prentice Hall Inc. 15-157. Schlegel, H.G., 1993, General Microbiology, 7 th ed, Translated by Margot Kogut, Cambridge University Press
35