Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA

Βιολογία κατεύθυνσης
ΚΕΦ.4

Μαυροματάκης Γιώργος
Βιολόγος

XANIA
2011-2012

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Τα βακτήρια άνοιξαν το δρόμο για την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου
DNA αφού μας προσφέρουν :

● Τα ένζυμα με τα οποία κόβουμε δίκλωνο DNA σε συγκεκριμένες θέσεις – περιοριστικές ενδονουκλεάσες
● Τα πλασμίδιά τους , που τα χρησιμοποιούμε ως φορείς κλωνοποίησης , μόρια DNA που μας βοηθούν να

μεταφέρουμε τμήματα DNA σε κύτταρα ξενιστές .
● Τα ίδια τα βακτήρια ως κύτταρα ξενιστές , τα μετασχηματίζουμε εισάγοντας σε αυτά ανασυνδυασμένα μόρια DNA

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Στάδια Τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA

● Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA .
Χρησιμοποιούμε 2 ένζυμα :
περιοριστική ενδονουκλεάση , DNA δεσμάση

● Μετασχηματισμός , εισαγωγή του ανασυνδυασμένου
DNA σε κύτταρα ξενιστές.
Το εμπόδιο που έχουμε να αντιμετωπίσουμε είναι τι
κυτταρικό τοίχωμα των βακτηρίων . Με κατάλληλη
επεξεργασία γίνεται διαπερατό σε μακρομόρια.

● Επιλογή των βακτηρίων που μετασχηματίστηκαν.
Με τη χρήση αντιβιοτικού επιλέγουμε τα βακτήρια
που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο μόριο DNA.

● Επιλογή του βακτηριακού κλώνου που περιέχει το
επιθυμητό τμήμα DNA.
Χρησιμοποιούμε ιχνηθετημένα μόρια ανιχνευτές

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε μια
ομάδα πανομοιότυπων μορίων ,
κυττάρων ή οργανισμών .

Ο όρος κλωνοποίηση αναφέρεται στην
κατασκευή κατά προτίμηση μεγάλου
αριθμού πανομοιότυπων μορίων ,
κυττάρων ή οργανισμών .

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Η ανακάλυψη των περιοριστικών ενδονουκλεασών έθεσε το θεμέλιο για τη δημιουργία
γονιδιωματικών βιβλιοθηκών .
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια και ο φυσιολογικός τους
ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή ξένου DNA .
Κόβουν τα μόρια του ξένου DNA σε μικρότερα κομμάτια , η πληροφορία καταστρέφεται ο
εισβολέας δεν έχει τις πληροφορίες για να πολλαπλασιαστεί !!
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 ζευγών
βάσεων και κόβουν , καταστρέφουν 1 φ-δ 3'-5' σε κάθε πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα .

Γράψτε τους δεσμούς που δείχνουν τα βέλη

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που
χρησιμοποιείται ευρέος είναι η EcoRI που
απομονώθηκε από το βακτήριο E.coli.
H EcoRI όποτε συναντά την αλληλουχία :

5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'
στο γονιδίωμα , κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του
G και του Α καταστρέφοντας τον φ-δ 3'-5'
αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες
βάσεις στα κομμένα άκρα . Τα άκρα αυτά
μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με
τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών
DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο.
Κόβουμε με την ίδια περιοριστική
ενδονουκλεάση το φορέα κλωνοποίησης και το
DNA του δότη για να δημιουργηθούν
συμπληρωματικές μονόκλωνες ουρές .

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

α).Βρείτε τα άκρα των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων
β).Βρείτε πόσοι φ-δ 3'-5' καταστράφηκαν και πόσοι δημιουργήθηκαν

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )
Σε πόσα τμήματα θα κοπούν τα παρακάτω μόρια DNA εάν επιδράσουμε την
περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI ;

3................CTTAAG.......................................CTTAAG.................................5
5................GAATTC.......................................GAATTC.................................3

5...............CTTAAG.........................................CTTAAG................................3
3...............GAATTC.........................................GAATTC................................5

3...............GAATTC...........................................CTTAAG..............................5
5...............CTTAAG...........................................GAATTC...............................3

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Προσοχή στον προσανατολισμό της αλληλουχίας που αναγνωρίζει και στη συνέχεια
κόβει η EcoRI !!!!!!!
Κόβει μεταξύ G και A δηλαδή το νουκλεοτίδιο με αζωτούχο βάση G συμμετέχει με το 3'
( OH ) ενώ το νουκλεοτίδιο με αζωτούχο βάση Α με το 5' ( Ρ )

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Τα κυριότερα ένζυμα στην τεχνολογία του
ανασυνδυασμένου DNA καταλύουν τη
διάσπαση ή το σχηματισμό φ-δ 3'-5' και
είναι :

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες με τις
οποίες κόβουμε το DNA . Καταστρέφουν
φ-δ 3'-5'

Οι DNA δεσμάσες με τις οποίες κολλάμε
DNA.
Δημιουργούν φ-δ 3'-5' .

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη
Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που
περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού
δότη αποτελεί μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη.
Παρατηρήσεις
Για να κατασκευάσουμε μια γονιδιωματική
βιβλιοθήκη απομονώνουμε το συνολικό DNA
απο το κύτταρο δότη .
Με τη κλωνοποίηση το έχουμε σε πολλά
αντίγραφα οπότε έτσι μας δίδεται η
δυνατότητα να το μελετήσουμε

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Σε πόσα τμήματα έκοψε η περιοριστική
ενδονουκλεάση το DNA δότη ;

Πόσα διαφορετικά ανασυνδυασμένα
μόρια DNA κατασκευάστηκαν ;

Από πόσους διαφορετικούς κλώνους
θα αποτελείται η γονιδιωματική
βιβλιοθήκη ;

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Βήματα στην έκφραση γονιδίων, ανάγκη
δημιουργίας πρωτείνών

Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τα
περισσότερα γονίδια είναι ασυνεχή ή
διακεκομμένα ( εξώνια + εσώνια ).
Τα βήματα στην έκφραση αυτών των
γονιδίων είναι 4 :
μεταγραφή , ωρίμανση ,μετάφραση ,
τροποποίηση πολυπεπτιδικής αλυσίδας.

Στα βακτήρια αντίθετα τα βήματα στην
έκφραση είναι 2 : μεταγραφή , μετάφραση.
Τα βακτήρια δεν διαθέτουν μηχανισμούς
ωρίμανσης και τροποποίησης

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Σε ποιά μορφή θα απομονώσουμε την γενετική πληροφορία που κωδικοποιεί μια
πολυπεπτιδική αλυσίδα απο ένα ευκαρυωτικό κύτταρο για να την ανασυνδυάσουμε και να τη
εισάγουμε σε βακτήριο με σκοπό την παραγωγή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας απο τα
γενετικά τροποποιημένα βακτήρια ;

Εαν απομονώσουμε το γονίδιο που την κωδικοποιεί το βακτήριο θα το μεταγράψει
κατασκευάζοντας πρόδρομο m-RNA . Μη διαθέτοντας όμως μηχανισμούς ωρίμανσης θα
μεταφράσει και τα εξώνια και τα εσώνια κατασκευάζοντας μια εντελώς διαφορετική
πολυπεπτιδική αλυσίδα απο αυτή που κατασκευάζεται στο ευκαρυωτικό κύτταρο.

Συνεπώς χρειάζεται να απομονώσουμε την γενετική πληροφορία στη μορφή που διαθέτει
μόνο εξώνια δηλαδή στη μορφή του ώριμου m-RNA .

Λόγω της γονιδιακής ρύθμισης το συγκεκριμένο γονίδιο δεν εκφράζεται σε όλους τους
τύπους των κυττάρων γιαυτό για να καταφέρουμε να απομονώσουμε το ώριμο m-RNA με
την πληροφορία που μας ενδιαφέρει θα χρειαστεί να απομονώσουμε κύτταρα στα οποία
εκφράζεται το συγκεκριμένο γονίδιο .
π.χ κύτταρα παγκρέατος όπου εκφράζεται το γονίδιο της ινσουλίνης .
Το γενετικά τροποποιημένο βακτήριο εκφράζοντας το γονίδιο κατασκευάζει προινσουλίνη
διότι δεν διαθέτει επιπλέον μηχανισμούς τροποποίησης.

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

cDNA βιβλιοθήκη

To σύνολο των βακτηριακών κλώνων που
περιέχουν αντίγραφα των m-RNA των γονιδίων
που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά.

Έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των
αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται
σε αμινοξέα , δηλαδή των εξωνίων .

Για να κατασκευάσουμε ανασυνδυασμένο DNA τα
μόρια ώριμου m-RNA που έχουμε απομονώσει
θα πρέπει καταρχήν να τα μετατρέψουμε σε
δίκλωνα DNA με την βοήθεια των ενζύμων :
αντίστροφη μεταγραφάση
και
DNA πολυμεράση

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )
Διαφορές Γονιδιωματικής , cDNA βιβλιοθήκης

Σε μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη υπάρχει το συνολικό DNA του κυττάρου δότη ,
δηλαδή όλα τα γονίδια με τις ρυθμιστικές τους περιοχές ( υποκινητές , αλληλουχίες
λήξης της μεταγραφής ) καθώς και το τμήμα DNA που δεν διαθέτει γονίδια.
Αντίθετα σε μια cDNA βιβλιοθήκη υπάρχουν μόνο τα εξώνια των γονιδίων που
εκφράζονται στο συγκεκριμένο τύπο κυττάρου.

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

1. Κατασκευάζουμε 2 γονιδιωματικές βιβλιοθήκες την πρώτη από κύτταρο δέρματος
και την δεύτερη από μυικό κύτταρο του ίδιου ανθρώπου.
Θα διαφέρουν ή θα είναι όμοιες ;

2. Κατασκευάζουμε 2 cDNA βιβλιοθήκες την πρώτη από κύτταρο δέρματος
και την δεύτερη από μυικό κύτταρο του ίδιου ανθρώπου.
Θα διαφέρουν ή θα είναι όμοιες ;

3. Από κύτταρα δέρματος ενός ανθρώπου κατασκευάζουμε μια γονιδιωματική και μια
cDNA βιβλιοθήκη . Θα διαφέρουν ή θα είναι όμοιες ;

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Ποιά ένζυμα χρησιμοποιούμε για να κατασκευάσουμε μια γονιδιωματική και ποιά για μια
cDNA βιβλιοθήκη ;

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη cDNA βιβλιοθήκη

Περιοριστική ενδονουκλεάση Αντίστροφη μεταγραφάση

DNA δεσμάση DNA πολυμεράση
Περιοριστική ενδονουκλεάση

DNA δεσμάση

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )
Μελέτη γονιδιώματος της Drosophilla

Εντοπίστε τα βήματα της τεχνολογίας του
ανασυνδυασμένου DNA με την βοήθεια
της διπλανής εικόνας.

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

Η επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου που
περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA
πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών μορίων
ανιχνευτών.

Αποδιάταξη ( Σπάμε δ. Υδρογόνου )
Αν επιδράσουμε στο DNA που απομονώθηκε
χημικές ουσίες ή αυξημένη θερμοκρασία τότε
σπάζουν οι δεσμοί υδρογόνου και οι 2 αλυσίδες
αποχωρίζονται.

Υβριδοποίηση ( Δημιουργία δ. Υδρογόνου)
Είναι μια πολύ σημαντική ιδιότητα του DNA που
μας δίνει την δυνατότητα αν έχουμε ένα γνωστό
μόριο DNA να το χρησιμοποιήσουμε ως
ανιχνευτή για τον εντοπισμό του
συμπληρωματικού του όταν το τελευταίο
βρίσκεται μαζί με χιλιάδες άλλα κομμάτια .

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

PCR ( Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης)
Αντιγράφουμε DNA in vitro

H PCR μας επιτρέπει να αντιγράφουμε επιλεκτικά
εκατομμύρια φορές , ειδικές αλληλουχίες DNA
από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA χωρίς την
μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου.
Ένζυμα που χρησιμοποιούμε :
περιοριστική ενδονουκλεάση ,
DNA Tag πολυμεράση .
Παρατήρηση Η επιλεκτική αντιγραφή ενός
τμήματος DNA ανάμεσα σε χιλιάδες άλλα γίνεται
με την προσθήκη έτοιμων πρωταρχικών
τμημάτων συμπληρωματικών στα άκρα του
τμήματος που θέλουμε να αντιγράψουμε .

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

[email protected]

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA - Βιολογία κατεύθυνσης ( Κεφ. 4 )

1. Για ποιό λόγο χρησιμοποιούμε την ίδια περιοριστική
ενδονουκλεάση για να κόψουμε το φορέα κλωνοποίησης και
το DNA του δότη ;
2. Στη δίπλα φωτογραφία εντόπισε το βακτήριο που δεν έχει
μετασχηματιστεί.
3. Πως γίνεται η επιλογή των βακτηρίων που δέχτηκαν
ανασυνδυασμένο DNA απο αυτά που δεν δέχτηκαν ;
4. Πως γίνεται η επιλογή του βακτηριακού κλώνου που
περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA ;

[email protected]