การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยือ่

ปจจุบันนี้ เทคโนโลยีดานการเกษตรไดกาวหนาไปอยางมาก เปนท่ีรูจักกันมากในขณะนี้คือ การตัด
ตอยีนสเพื่อใหสายพันธุพืชสายใหมที่ทนตอโรค แมลง และใหผลผลิตสูง หรือรูจักกันในนามพืช GMO ท่ี
กําลังเปนปญหาถกเถียงกันในขณะนี้วาพืชบางอยางไดตัดตอยีนสแลวบางตัวมีผลทําใหแมลงตาง ๆ ตาย ซ่ึง
แมลงบางตัวเปนแมลงทีมีประโยชน อาจสงผลใหสภาพความสมดุลทางธรรมชาติสูญเสียไปดวย การ
เพาะพันธุตนไมในสภาพที่ปลอดเช้ือหรือ การเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือพืช (Tissue Culture) เปนอีกวิธีหนึ่งของ
เทคโนโลยีดานการเกษตรชนิดอ่ืนที่นอกเหนือจากพืชสวน พืชไร ไมดอก เชนการเพาะเลี้ยงเย่ือสมุนไพร
เพราะวิธีการน้ีสามารถขยายพันธุไดเร็วและจํานวนมาก แตมีขอเสียอยูคือตนทุนในการจัดต้ังหองปฏิบัติการ
คอนขางสูง และข้ันตอนในการปฏิบัติการขยายพันธุคอนขางยาก ถาเทียบกับการขยายพันธุไมดอก กลวยไม
หรือไมประดับ เพราะวาสมุนไพรในแตละชนิดจะมียาง ซึ่งในยางนั้นจะมีตัวยาแตกตางกันไป และตัวยาใน
ยางของสมนุ ไพรนเี่ องทม่ี กั จะทําปฏิกริยากบั ธาตอุ าหารสงั เคราะหท่ใี ชเล้ยี งตน พชื สมุนไพร บางครงั้ อาจทําให
พืชนั้นไมเจริญเติบโต ไมแตกกอ ไมดูดสารอาหาร และจะทําใหพืชนั้นตายในที่สุด แตถาหากทดลองสูตร
อาหารไดสูตรทีเ่ หมาะสมกับพืชนั้นๆ ก็จะเจรญิ เติบโตไดดี
การเพาะเลย้ี งเน้ือเยอ่ื พืช คือ การนําสวนใดสว นหนึ่งของพืชไมว า จะเปน สวนเนื้อเยือ่ อวัยวะตาง ๆ ของพืช
หรอื เซลล มาเล้ยี งในสภาพที่ปลอดเชอ่ื จุลินทรีย โดยมกี ารควบคมุ สภาพแวดลอม เชน อณุ หภูมิ แสง ความชน้ื
สว นตางๆ ของพชื เหลานีจ้ ะสามารถเจริญเตบิ โตพัฒนาเปนตน ใหม โดยท่พี ชื ทกุ ตนจะมีลักษณะเหมอื นกนั
ดว ยเหตนุ ้กี ารเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พืชจึงมีประโยชนอ ยา งกวางขวางในหลายสาขา เชน ทางดานการเกษตรทําให
สามารถขยายพนั ธไุ ดจ าํ นวนมากในเวลาอนั รวดเรว็ หรือสามารถผลิตตน พันธทุ ป่ี ลอดเชอ้ื ไดจ าํ นวนมาก และ
ยงั สามารถสรางพันธุใ หม ๆ ไดโดยการเพาะเลยี้ งคพั ภะ (Embryo) อบั ละอองเกสร (Anther Culture)
นอกจากนเ้ี ทคนิคการเพาะเลีย้ งเน้ือเย่ือพืชยงั มคี วามสาํ คัญ สาํ หรบั การเกบ็ รักษาพันธุพ ชื ในสภาพปลอดเชอ้ื ได
ดี

ประโยชนข องการเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่
คุณสมบตั ิทถ่ี กู นํามาใชใ หเกิดประโยชนข องวธิ เี พาะเลี้ยงเนอ้ื เยือ่ มีหลายขอพอสรุปไดด ังนี้

1. สามารถผลิตตนพันธุพืชปรมิ าณมาณมากในระยะเวลาอนั รวดเรว็ ตัวอยางเชน หากพชื สามารถเพิม่
ปรมิ าณได 3 เทา ตอการยา ยเนอื้ เยื่อลงอาหารใหมท ุกเดอื นๆ ละ 1 ครงั้ เมอื่ เวลาผานไป 6 เดือน จะ
สามารถผลิตตนพนั ธุพชื ไดถึง 243 ตน

2. ตน พชื ท่ผี ลติ ไดจะปลอดโรค โดยเฉพาะโรคท่ีมสี าเหตจุ ากเช้อื ไวรสั มายโคพลาสมา ดว ยการตดั
เน้อื เยือ่ เจรญิ ทอ่ี ยูบริเวณปลายยอดของลาํ ตน ซึง่ ยงั ไมม ีทอ นํ้าทออาหาร อนั เปนทางเคลื่อนยายของ
เชอ้ื โรค
ดงั กลา ว

3. ตนพืชทผี่ ลติ ได จะมลี ักษณะทางพันธกุ รรมเหมือนตน แม คือ มลี ักษณะตรงตามพันธุ ดว ยการใช
เทคนคิ ของการเลยี้ งจากชิน้ ตาพืชพฒั นาเปน ตนโดยตรง หลีกเล่ียงขั้นตอนการเกดิ กลมุ กอ นเซลลที่
เรียกวา แคลลัส

4. ตน พืชท่ีผลติ ไดจ ะมขี นาดสม่ําเสมอ ผลผลติ ทีไ่ ดมีมาตรฐานและเกบ็ เก่ียวไดคราวละมากๆ พรอ มกนั
หรอื ในเวลาเดยี วกัน

5. เพอื่ การเก็บรกั ษาหรอื แลกเปล่ยี นพันธพุ ชื ระหวา งประเทศ เชน การมอบเช้อื พันธุกลว ยในสภาพ
ปลอด
เช้ือขององคก รกลว ยนานาชาติ (INIBAP) ใหกรมสง เสรมิ การเกษตร เมอื่ ป พ.ศ. 2542

6. เพอ่ื ประโยชนด านการสกดั สารจากตน พืช นํามาใชป ระโยชนดานตางๆ เชน ยาฆา แมลง
ยารักษาโรค เปน ตน

นอกจากนี้ ยงั มคี ุณประโยชนอ ีกหลายประการ เชน เพือ่ การผลิตพืชทนทานตอ สภาพแวดลอม ทนกรด
ทนเคม็ เปน ตน หรือการใชป ระโยชนเ กยี่ วกับการศกึ ษาทางชีวเคมี และสรีรวทิ ยาของพืช เปน ตน ในสว นของ
กรมสง เสริมการเกษตรไดน าํ ประโยชนขอ 1-4 มาเปนขอกําหนดคณุ ลักษณะพนั ธุพืชท่ผี ลิตดว ยวธิ ีการ
เพาะเลย้ี งเนื้อเย่ือกอ นนาํ เขา ระบบสงเสรมิ สเู กษตรกร คือ ตนพันธุพชื ท่ีผลิตไดต อ งปลอดโรค มีลักษณะตรง
ตามพันธุและสามารถขยายไดปริมาณมากในเชงิ อุตสาหกรรม นบั เปน หนว ยงานแรกของภาครัฐทมี่ ีการนาํ
เทคโนโลยีเพาะเลี้ยงเนอื้ เยื่อมาพัฒนาใชก บั งานขยายพันธุพืชเศรษฐกจิ ในเชิงพานิชยอ ยา งเปนรูปธรรมและ
พรอ มนําไปใชใ นระบบสงเสรมิ ตวั อยา งพันธพุ ืชเพาะเลย้ี งท่มี ีการทดลองนํารองปลูกในสภาพไร และประสบ
ผลสําเร็จเปนอยางดี ไดแ ก หนอ ไมฝรั่ง กลว ย ออ ย สบั ปะรด ไผ เบญจมาศ และสตรอเบอร่ี เปนตน

อปุ กรณ
อปุ กรณที่ใชก บั งานเพาะเลย้ี งเนือ้ เยื่อคอ นขางมมี ากชนิด การจัดวางเครอ่ื งมือตองคํานงึ ถึงความสะดวกใน การ
ใชต อ พื้นท่ีใหเ กดิ ประโยชนม ากทีส่ ุดถากําหนดชนิดของเครือ่ งมอื ตามตําแหนงของการใชง านภายในหอง
ปฏบิ ตั ิการ จะแบงออกเปน 3 หอ งใหญๆ คอื

1. หอ งเตรยี มอาหาร
2. หองตัดเน้อื เยอ่ื
3. หอ งเลย้ี งเนือ้ เยือ่
ภายในแตละหอ งจะมอี ปุ กรณแ ละเครือ่ งมือทีใ่ ชงานเปน ประจาํ แตกตา งกนั ไปตามลกั ษณะงานดงั น้ี

1 หองเตรยี มอาหาร เปน หอ งทีใ่ ช เ ก็บสารเคมแี ละวัสดุอปุ กรณเพ่อื การช่ังสาร หรอื ผสมอาหาร
หมอนงึ่ ความดันไอ ตูอบความรอนแหง ดังนี้

จดั วางในตหู รือบนชน้ั วางของอยา งเปน ระเบียบเปน หมวดหมหู รือตามอกั ษรที่สําคัญ
ควรอยบู รเิ วณเดียวกับทวี่ างเครอ่ื งชงั่

1.2 เครือ่ งชง่ั เคร่ืองวัดความเปน กรด-ดาง ควรวางอยบู นโตะ ทม่ี ่นั คงไมส นั่ สะเทอื นงาย

1.3 เคร่ืองแกวและเคร่ืองมอื อื่นๆ ควรมีท่เี กบ็ มิดชดิ และไมห า งจากอางนํ้ามากนกั

1.4 อา งนํ้า ใชส าํ หรับลางทาํ ความสะอาดเครอ่ื งมอื ตางๆ เพ่ือความสะดวกตอการปฏบิ ตั งิ าน อาจอยูมมุ หน่ึง
ของบริเวณหอง

1.5 บรเิ วณเตรยี มอาหาร ควรเปน โตะหรอื พนื้ ท่ีทีม่ คี วามสงู พอท่ีจะปฏบิ ตั ิงานในลกั ษณะยืนหรือนง่ั กไ็ ด

1.6 เครอ่ื งกรองนาํ้ อาจใชเ ครอ่ื งกรองนํา้ ดม่ื ตามบานได

1.7 เคร่อื งชงั่ มี 2 แบบ คอื เครอ่ื งชง่ั อยา งละเอยี ด และเครอ่ื งช่ังอยา งหยาบ
-- เครอ่ื งชงั่ อยา งละเอียด สามารถชั่งไดเ ปนมิลลกิ รัม หรือทศนิยม 4 ตาํ แหนง ใชสาํ หรบั ชั่งสารเคมี วติ ามิน
และสารควบคมุ การเจริญเตบิ โต ซ่งึ ใชป ริมาณนอยมาก
-- เครอ่ื งช่งั อยางหยาบ ชงั่ ไดเ ปน กรมั หรอื ทศนยิ ม 2 ตําแหนง ใชส าํ หรบั ชง่ั สารเคมีทใ่ี ชปรมิ าณมาก เชน วนุ
และนํา้ ตาล

1.8 เครอ่ื งวดั ความเปนกรด-ดา ง (pH-meter) ใชวัดคาความเปน กรด-ดา ง ของอาหารสงั เคราะห
ควรอยูทรี่ ะดบั 5.6

1.9 เคร่อื งคนสารละลาย ใชสาํ หรับคนสารละลายเมือ่ ใสแทง คนไฟฟา (Magnetic stirror) ขณะ
เตรยี มอาหาร

1.10 เตาตม อาหาร อาจเปนเตาไฟฟาหรือเตาแกส ใชสาํ หรับตม อาหารเพ่อื ใหว นุ ละลาย

1.11 ตูอบความรอ นแหง (Hot air oven) ใชใ นการอบฆาเช้อื เครือ่ งแกวและอปุ กรณใ นการตัดยา ย เนือ้ เย่อื โดย
ใชอณุ หภมู ิ 180 องศาเซลเซียส เปน เวลา 2-3 ชั่วโมง

1.12 เคร่อื งแกว ปจ จุบนั นยิ มใชเปน พลาสตกิ เพราะลดความเสยี หายจากการแตกรา วไดคอ นขางมาก
-- ฟลาสคหรือขวดรูปชมพู ขนาด 50-1,000 มิลลิลติ ร
-- บกี เกอร ใชป รบั ปรมิ าตรของอาหาร ขนาด 20-1,000 มิลลิลติ ร
-- กระบอกตวง ขนาด 5-1,000 มลิ ลิลติ ร
-- ไปเปต ใชดดู สารละลายปริมาณนอ ย ขนาด 0.1-10 มลิ ลลิ ิตร

1.13 หมอนึ่งความดนั ไอ (Autoclave) ใชน ง่ึ ฆา เชอื้ จลุ นิ ทรียในอาหารวุน โดยใชค วามรอ น ที่
อณุ หภมู ิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดต อตารางน้ิว เปน เวลา 15-20 นาที อาจเปนแบบหมอ ไฟฟา
อัตโนมัติ หรือเปน แบบทใี่ ชค วามรอนจากเตาแกส มีทั้งแบบแนวตงั้ และแนวนอน หมอแบบแนวนอนจะมี
ความจุมากกวา หมอ แบบแนวตง้ั และมีราคาคอนขา งสงู
-- หมอ น่ึงความดันไอแบบใชไฟฟา แนวตงั้ เปนแบบที่ไดร บั ความนยิ ม มีใชใ นหอ ง
ปฏบิ ตั กิ ารเพาะเลย้ี งเนือ้ เยื่อเกือบทุกแหง
-- หมอ น่งึ ความดนั ไอ แบบใชไ ฟฟาแนวนอน สามารถนงึ่ อาหารไดปรมิ าณมากกวาหมอ
แบบแนวตง้ั
-- หมอนึ่งความดันไอ แบบใชแ กส ใชหลักการเดยี วกบั หมอ นึง่ เชอื้ เหด็ ประสทิ ธิภาพการ
ทาํ งานสงู หรอื ตา่ํ ขนึ้ อยูก ับผปู ฏบิ ัติงาน สามารถควบคุมอณุ หภมู ิ และความดันใหคงที่ตามกําหนดเวลา ได
หรอื ไม

2 หองตัดเนอ้ื เยือ่ เปนหอ งทมี่ เี จาหนา ท่ีปฏบิ ัตงิ านมากทสี่ ดุ ศูนยรวมของกิจกรรมเพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือ
จะอยใู นหอ งน้ี ควรเปน หองทมี่ รี ะบบปอ งกันการปนเปอ นของเชอ้ื ผวิ พนื้ หอ งทกุ ดา นทงั้ ฝาผนงั พืน้ หอง ควร
มีผดิ เรียบมนั ไมเปน ท่ีสะสมของฝุนละออง ทําความสะอาดงาย วสั ดอุ ปุ กรณท ี่อยใู นหองนี้จะประกอบไปดว ย
ตตู ัดเนื้อเยื่อ จาํ นวนมากนอยเปนไปตามปริมาณการผลติ ของแตละแหง ดงั นี้

2.1 ตตู ดั เนอื้ เยอ่ื เปน ตปู ลอดเชอื้ ที่ใชกบั งานตดั ยา ยชิน้ พชื มีระบบการหมุนเวยี นของอากาศภายในตทู สี่ ะอาด
ปราศจากเช้อื จลุ นิ ทรียตลอดเวลาของการปฏบิ ัตงิ าน ดว ยระบบการถายเทอากาศผานแผนกรองทีม่ ีรูพรนุ
ขนาดเลก็ ประมาณ 0.3 ไมครอน ซ่ึงเช้อื จุลนิ ทรยี ไมสามารถเล็ดลอดผา นได ท้ังนี้ควรเช็ดทาํ ความสะอาดตทู งั้
กอ นปฏบิ ัติงานและหลังเลกิ งานในแตล ะวนั โดยเชด็
ออกดา นนอกตูเสมอดวยแอลกอฮอล 70% รวมท้งั การเปล่ียนแผน กรองเช้ือจุลนิ ทรยี ต ามกําหนดเวลาเพอื่ รักษา
ประสิทธภิ าพความเปน ตูปลอดเชือ้

2.2 วัสดุหรอื เคร่อื งมอื ทใ่ี ชตัดเนื้อเยื่อ ไดแก
- มดี ผา ตดั นยิ มใชดา มมดี เบอร 3 กบั ใบมีดเบอร 10 หรอื 11
- ปากคบี (forcepts) ใชหนีบจับชิน้ พืช มขี นาดความสัน้ ยาว ตา งกันไปขึน้ กับความสะดวกในการปฏิบัตงิ าน
- ตะแกรงสําหรบั วางมดี และปากคบี
- ตะเกียงแอลกอฮอล
- จานรองหรือกระดาษ ทผี่ า นการน่งึ ฆาเชอ้ื แลว ใชรองตดั ช้ินเนื้อเยอื่
วัสดุเหลา นก้ี อ นนาํ มาตดั เนอ้ื เยื่อตองทาํ การฆาเชื้อจุลนิ ทรยี โดยการนงึ่ ฆา เชือ้ ดว ยหมอ น่ึงความดนั ไอ
หรอื การอบความรอ นแหง ภายหลงั ส้ินสดุ การปฏิบัตงิ านทกุ ครัง้ ตองนําเครื่องมอื เหลา นัน้ มาลา งใหส ะอาดดว ย
นาํ้ ยาลางจาน เช็ดใหแ หง หอดว ยกระดาษตะกว่ั แลวจงึ นําไปฆา เช้อื จลุ นิ ทรยี เ พื่อการนาํ มาใชใ หมใ นครั้งตอ ไป

2.3 อุปกรณอ นื่ ๆ ไดแก
1. เกาอ้มี พี นกั สําหรับพนกั งานตัดเนอ้ื เย่ือ
2. รถเข็นสําหรับวางขวดอาหาร ขวดเน้ือเยือ่ พชื
2.4 อุปกรณดบั เพลงิ ควรมปี ระจาํ ทกุ ชน้ั และทกุ หอ ง โดยเฉพาะหองตัดเนอ้ื เย่ือเพราะขณะปฏบิ ตั ิ
งาน มีการลนไฟฆา เชื้อวสั ดอุ ุปกรณต ลอดเวลา อาจเกดิ อบุ ตั เิ หตุไฟลกุ ไหมภายในตไู ด

3 หอ งเล้ียงเนอื้ เยอ่ื เปนหอ งปลอดเช้ือ ควบคุมอณุ หภมู ใิ หอยูระหวา ง 25-25 องศาเซลเซียส ใชเ ปนสถานทว่ี าง
ขวดเน้ือเยอ่ื พชื เปน หอ งท่ไี มค วรอนุญาตใหผทู ไ่ี มม หี นา ท่เี ก่ียวของเขา ออกโดยเดด็ ขาดเพราะจะทําใหเกดิ การ
ปนเปอ นของเชอ้ื จลุ ินทรยี ใ นขวดเนื้อเย่อื พชื อาจทาํ ใหเ กิดความเสียหายกับตนพันธพุ ชื ในภาพรวมได อปุ กรณ
ทสี่ าํ คัญท่ีติดต้ังอยใู นหอง ไดแก

3.1 ชัน้ วางเนอ้ื เยอ่ื วัสดุทีป่ ระกอบเปนชนั้ อาจทาํ ดว ยไม เหลก็ ฉาก แสตนเลส หรืออลมู ิเนยี ม
เปน ตน ขนาดกวาง x ยาว x สงู ประมาณ 60 x 125 x 200 มชี ั้นวาง 5 ชน้ั แตละชนั้ หา งกนั ประมาณ 30
เซนติเมตร โดยสว นท่ที ําเปน พื้นควรจะเปน กระจกหรือฟอรไ มกา สีขาว หรือเปนตาขายโปรง มีหลอดไฟฟาท่ี
ใหความสวา งแกพ ืชเพ่อื การสังเคราะหแสง นิยมใชห ลอดไฟทเี่ รยี กวา Grolux เพราะมีคุณสมบัตขิ องการให
แสงสีแดง ซึ่งเหมาะกับการสงั เคราะหแสงของพชื แตหลอดชนดิ น้ีมรี าคาคอนขางสูง จงึ อาจใชห ลอดไฟ
ฟลอู อเรสเซนต ชนิดธรรมดาท่ีใชกบั อาคารบา นเรือนก็ได ทั้งนี้การติดต้ังหลอดไฟควรใหห ลอดอยหู างจากชนั้
วางเนือ้ เยื่อในระยะประมาณ 20 เซนติเมตร และแตละหลอดอยูหา งกนั ประมาณ 30 เซนตเิ มตร เพอ่ื ใหได
ความเขมแสง 2,000-3,000 ลักซ เมื่อวดั ดวยเคร่อื งมือ ทเ่ี รยี กวา Lux meter โดยเปด ไฟติดตอ กนั นาน
16 ชว่ั โมงตอ วนั จึงควรมนี าฬกิ าควบคมุ การปด -เปดไฟฟา (timer) ดวย

3.2 เครอ่ื งเขยาแบบโยก ใชส ําหรบั เนอ้ื เยอ่ื พืชท่เี ลีย้ งในอาหารเหลว มีลกั ษณะการเคลอื่ นทใ่ี นแนว
ขนานกับพน้ื โลกอัตรา 100-150 รอบตอ นาที เปน การเพมิ่ ออกซิเจนลงไปในอาหารเพอื่ ใหเน้ือเย่ือพืชไดรับ
ออกซเิ จนอยา งเพยี งพอตอ การเจรญิ เตบิ โต

กิจกรรมภายในหองเตรยี มอาหาร

การปฏบิ ตั งิ านภายในหอ งเตรยี มอาหาร จะเริ่มตนจากการชั่งสารตามสูตรอาหารที่ตองการผสมเปน สตอ็ ก
สารละลาย ปรับคาความเปนกรด-ดา ง หลอมอาหาร และบรรจขุ วดกอนนง่ึ ฆาเชื้อเพอื่ รอการนาํ ไปใช
ตามลาํ ดบั ดงั นี้

1. ช่งั สารเคมี เปนขนั้ ตอนทส่ี ําคญั ขน้ั ตอนหน่งึ ตองการความแมน ยาํ สงู โดยเฉพาะสารเคมที ีใ่ ชป รมิ าณนอย
จึงตอ งช่ังดว ยเครอ่ื งชั่งอยา งละเอียด สามารถช่งั ไดทศนยิ ม 4 ตาํ แหนง

2. สาํ หรับสารเคมที ใี่ ชป ริมาณมาก จะช่ังดว ยเครอ่ื งช่งั อยา งหยาบ ชัง่ ไดท ศนิยม 2 ตําแหนง เชน นาํ้ ตาล หรือ
วุน

3. ผสมสารเคมี ตองทาํ ใหส ว นประกอบของสารเคมลี ะลายผสมเขา กันไดห มด โดยใชเ ครือ่ งคนสารละลาย
รว มกบั แทงคนไฟฟา

4. วัดความเปน กรด-ดา ง (pH) ใหป รบั ใชท ร่ี ะดับ 5.6 ซ่ึงเหมาะสมตอ การทพ่ี ชื จะนาํ ธาตอุ าหารไปใชใ นการ
เจรญิ เติบ แตในอาหารบางสูตรอาจใชทีร่ ะดับ pH 5 เชน อาหารกลวยไม

5. หลอมอาหาร เมอื่ ผสมอาหารเสรจ็ เรียบรอยแลว นาํ มาหลอมวนุ ใหล ะลายบนเตาแกสหรือไมโครเวฟกไ็ ด

6. กรอกอาหาร ลงภาชนะตา งๆ เชนขวดหรือถงุ หรอื กลองพลาสตกิ เปนตน แตภ าชนะที่ตองทนความรอ น
และสิง่ ทีต่ อ งระมดั ระวงั ขณะกรอกอาหาร คอื พยายามอยา ใหอาหารเลอะปากภาชนะ เพราะเปน สาเหตขุ อง
การปนเปอนจากเชอ้ื จลุ ินทรยี ไ ดง าย

7. อาหารวุนในขวด กรอกอาหารลงขวดขนาด 4 ออนซ (ขวดน้าํ พรกิ เผา) ปรมิ าณอาหารที่กรอกขวดละ 20-25
มลิ ลลิ ิตร (1 ลติ รกรอกไดป ระมาณ 40-45 ขวด) ปด ฝาใหส นทิ นาํ ไปนงึ่ ฆาเช้ือ

8. อาหารวนุ ในถุง กรอกอาหารลงถงุ ขนาด 4*6 น้ิว (ถุงรอน) ปริมาณอาหารที่กรอกถุงละ30-35 มลิ ลลิ ิตร (1
ลติ ร กรอกไดป ระมาณ 25-30 ถุง) นําไปนง่ึ ฆาเชอ้ื

9. นําอาหารวนุ เขาหมอน่ึงความดนั ไอ เพอ่ื น่ึงฆา เชอื้ เมอื่ เตรียมอาหารเรียบรอ ยแลว ควรทาํ ใหปลอดเชอ้ื
ภายในวนั เดยี วกนั ดว ยหมอ นึ่งความดนั ไอทอ่ี ณุ หภมู ิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอ ตารางน้วิ เปน
เวลา 15-20 นาที (เวลาอาจปรบั เปลยี่ นตามขนาดของภาชนะและปริมาตรของอาหาร) เมอ่ื น่งึ ฆา เชอื้ เรยี บรอย
แลว รีบนาํ อาหารออกจากหมอ น่ึงความดนั ไอทันทที ค่ี วามดนั ลดลงเปน 0 ถา เปนขวดควรปด ฝาใหแ นน
เน่ืองจากฝาขวดอาจขยายตัว เม่อื ผา นการนง่ึ ฆา เชื้อแลว และควรเกบ็ ไวป ระมาณ 1 สัปดาหกอนนาํ ไปใช เพอ่ื
ตรวจสอบอกี ครง้ั วา ไมม กี ารปนเปอ นของเชอื้ จลุ นิ ทรยี 

10. สต็อกอาหารวนุ ผา นการนึง่ ฆา เชอ้ื แลว เก็บไวประมาณ 1 สปั ดาห กอ นนํามาใช

กจิ กรรมภายในหองตดั เนอ้ื เยอ่ื

จะเปนการตัดยายเนอื้ เยือ่ ไปเล้ยี งบนอาหารใหม ซึง่ ตองอาศยั เทคนคิ ปลอดเชื้อ เจาหนา ท่ปี ระจํา
หองปฏบิ ัติการ ตองเตรียมตวั ใหอ ยใู นสภาพท่ีพรอมทํางานตงั้ แตทาํ ความสะอาด มอื และแขนดวยสบู สวมผา
คลุมผม ใสถ ุงมือ ผา ปด ปากปด จมกู และสวมชดุ ปฏิบัติการ เปน ตน ตามลําดบั ดังนี้
1. การรักษาความสะอาดดว ยการลางมือใหสะอาดดว ยสบู และสวมชดุ ปฏบิ ตั กิ าร ประกอบดว ยถงุ มือ ผาคลมุ
ผม ผาปด ปากปด จมูก และเปลี่ยนรองเทากอ นเขาหองปฏิบัตกิ ารทกุ ครั้ง
2. เชด็ ทําความสะอาดตูปลอดเชอื้ กอนใชงานและควรเปด สวิทซต ใู หร ะบบตางๆ ภายในตูทาํ งานกอ น
ปฏบิ ตั ิงาน 15-30 นาที
3. วางอปุ กรณท ่ใี ชตัดเน้ือเยอ่ื ในตาํ แหนง ท่ีเหมาะสมและสะดวกตอการปฏบิ ัติงาน
4. การลนไฟเคร่ืองมือทใ่ี ชปฏิบตั ิงานเพอ่ื ฆาเชอ้ื จลุ นิ ทรยี กอ นเร่มิ ตดั เน้อื เยื่อ
5. ตดั เนอื้ เย่อื ปลายยอด apical meristem ในกรณที ่ผี ลิตปลอดโรค
6. ตดั เนือ้ เยอื่ ระยะเพิ่มปริมาณภายในตปู ลอดเช้ือ
7. นําชิ้นพชื ทตี่ ดั แบง วางเลยี้ งบนอาหารในขวดกอนปด ฝา
8. ลนไฟปด ปากถงุ
9. ลงบันทกึ ชนดิ พชื และ วนั /เดือน/ป ทตี่ ดั ยา ย
10. เนื้อเยือ่ พชื พรอมนาํ เขาเรียงบนช้ันในหอ งเลยี้ งเนอื้ เยอื่ ทีค่ วบคมุ แสง และอุณหภมู ิ

กจิ กรรมภายในหอ งเล้ียงเนอ้ื เยอื่

1. นําขวดเน้ือเย่อื พชื ทเ่ี ปล่ยี นอาหารใหม เขา หองเลี้ยงเนอื้ เยือ่
2. ทําความสะอาดช้ันเรียงพชื ดวยแอลกอฮอล 70% กอนเรียงเน้ือเยือ่ พชื
3. นําถงุ เน้อื เยอื่ พืชวางเรยี งบนชน้ั ทมี่ คี วามเขม แสง 2,000-3,000 ลักซ
4. เน้อื เยอื่ พืชระยะเพมิ่ ปริมาณในขวด
5. เนอ้ื เยอ่ื พืชระยะสดุ ทา ย (เกดิ ราก) ในถุง
6. ตรวจสอบการปนเปอ นเชอื้ จลุ นิ ทรียหากพบจะตองเกบ็ ทิ้งทนั ที หากปลอยทงิ้ ไวจ ะทาํ
ใหสปอรของเช้อื ราแพรกระจายออกจากขวดสบู รรยากาศของหองได
7. คัดเลือกแมพ นั ธุ เพ่อื การตดั -ขยาย
8. บนั ทกึ รายละเอียดและลักษณะของชนิ้ พชื
9. เตรยี มสง พชื เน้ือเย่อื ออกปลกู ในสภาพโรงเรือน
เมื่อตน พันธุพชื เพาะเลีย้ งเนอ้ื เยอ่ื ผลติ ไดครบจาํ นวนตามเปาหมาย จะถกู จัดเตรยี มเพอื่ นาํ ออก
อนบุ าล ในสภาพโรงเรอื น

วธิ ีการเพาะเลี้ยงเนอื้ เย่ือโดยสังเขปการเพาะเลี้ยงเนือ้ เยอ่ื พืชประกอบดว ยข้นั ตอนสาํ คญั หลัก 6 ข้ันตอน คอื
1. การคัดเลอื กเน้ือเยือ่ พชื
2. การฟอกฆาเชื้อ
3. การเตรยี มอาหารสาํ คัญเพาะเล้ยี งเนอื้ เย่ือ
4. การขยายพนั ธเุ พมิ่ จํานวน
5. การชักนํารากพืช
6. การยา ยออกปลกู

การทจ่ี ะทาํ การเพาะเลีย้ งเนอ้ื เยอื่ พชื ใหไดผ ลน้ันขน้ั แรกตองฆาเช้ือหองปฏิบตั ิการเพราะการเพาะเล้ยี งเน้ือเย่ือ
พืชนเ้ี ปนการเลี้ยงในสภาพท่ปี ลอดเชื้อ หองปฏบิ ตั ิการและเครอื่ งมอื ทุกอยา งตองปลอดเชื้อจลุ ินทรยี  เพราะจลุ ิ
นทรียเปน ศัตรตู ัวฉกาจที่จะทําใหก ารทาํ งานของเรามีปญ หาท่สี ุด และนอกจากฆาเช้ือหอ งและอปุ กรณแลว
ช้ินสวนพืชทจ่ี ะนาํ มาขยายพนั ธตุ อ งทําการฆา เช้ือดว ย เรยี กวา วธิ ีฟอกฆา เชอ้ื ขนั้ ตอนในการทําก็คอื

1. เลอื กช้นิ สว นพชื ท่ีอยใู นชว งเจริญเตบิ โต เชน ยอดออ น เมลด็ ตาขาง ปลายราก แลว แตชนดิ ของพชื นั้น ๆ
2. นาํ ช้นิ สวนนัน้ มาตดั เปน เปน ทอ นใหส วนขอท่ีจะออกรากควรอยตู รงกลาง .....หรอื ถาเปน เมล็ดควรทําความ
สะอาดแตถ าเมลด็ นนั้ แข็งควรนาํ ไปแชน าํ้ อนุ สัก 1 คืน
3. เตรียมน้าํ ปรมิ าณขวดละ 90 ml นําไปนง่ึ ฆาเช้ือที่อณุ หภมู ิ 121 Cํ เปนเวลา 15 นาที

4. เม่ือไดนาํ้ ทผี่ านการฆาเชอื้ แลว ตวง Chlorox ปริมาณ 10-15 ml หยด Tween ประมาณ 2-3 หยด ถา เปนพืชท่ี
คอ นขา งสกปรกใสย าฆา เชอื้ (Anti biotic) ดว ย
5. นาํ ชน้ิ สว นทีล่ างสะอาดแลว ใสล งไปในขวด แลว เขยา ประมาณ 15 นาที
6. หลงั จากเขยา ครบ 10-15 นาทแี ลว ลางดว ยนา้ํ กล่ัน 3 ครัง้ คร้ังละ 15 นาที แตควรทาํ ภายใตสภาพปลอดเชอ้ื
7. หลงั จากทําการฟอกฆาเชอื้ แลว นําช้นิ สวนลงปลกู ในขวดอาหารทเี่ ตรยี มไว

วธิ กี ารเลอื กชิน้ สวนเนือ้ เยอื่ ทจี่ ะนาํ มาฟอกฆาเชอื้

1. พืชทเ่ี ปนเมล็ดควรเลือกเมล็ดที่มคี วามสมบรู ณท่ีสดุ เมล็ดออนหรือแกก ็ได
2. พชื ทีใ่ ชใ บขยายพนั ธุ เชน แอฟรกิ นั ไวโอเลต กลอกซเี นีย หรือกกุ ลายหิน ควรเลือกใบเพ่ิงแตกใหม
....เพราะการปนเปอนนอ ยและเย่อื กาํ ลงั เจริญ
3. พืชท่ีใชย อดขยายพนั ธุ ควรเลอื กยอดที่เพ่ิงจะแตกตาใหม เพราะเปน ชว งทพ่ี ืชพรอมจะเจรญิ เปน ตน
4. พชื ที่เปน หวั เปนเหงาหรอื แงง เชน กลว ย ขงิ ดาหลา ควรเลือกที่มตี าสมบรู ณ ถาเปนกลวย
.... ควรเลือกหนอ ทม่ี ีใบแคบหรือหนอ ทก่ี าํ ลังงอก
5. พชื ทีใ่ ชคพั ภะ ควรเลอื กคพั ภะทแี่ ก ไมค วรเลือกทอี่ อนเกนิ ไปจะไมงอก

ชนดิ ของเนือ้ เยือ่
เนอื้ เยือ่ ของพชื แบงเปน 2 ประเภท ตามความสามารถในการแบง ตัวของเนอื้ เยอื่ คอื
1. เนอื้ เย่อื เจริญ (meristematic tissue) จาํ แนกเปน 3 ชนดิ ตามตําแหนงที่อยใู นสว นตา ง ๆ ของพืช คือ
1.1 เน้อื เยอื่ เจรญิ สวนปลาย (apical meristem) พบตามบรเิ วณปลายรากและปลายยอดพชื
เม่อื แบงเซลลทําใหร ากและลําตน ยืดยาวออก
1.2 เนอ้ื เยอ่ื เจริญเหนือขอ (intercalary meristem) อยูบริเวณเหนอื ขอหรอื โคนของปลอง

1.3 เน้อื เย่อื เจรญิ ดา นขา ง (lateral meristem) จะแบงตวั ออกทางดานขา ง ทําใหร าก และ
ลําตน ขยายขนาดใหญขึ้น
2. เนือ้ เย่ือถาวร (permanent tissue) เปนเนอื้ เยอ่ื ที่เจรญิ เปล่ียนแปลงมาจากเนอ้ื เยอ่ื เจรญิ แบง ออกเปน 2
ประเภท คอื
2.1 เนือ้ เยอื่ ถาวรเชิงเดยี่ ว (simple permanent tissue) แบงไดห ลายชนิดตามหนา ทแี่ ละสวนประกอบภายใน
เซลล ไดแก
1. เอพิเดอรมิส (epidermis) คือ เน้อื เย่อื ทอ่ี ยูช้นั นอกสุดของสว นตาง ๆ ของพืช มกั เรยี งตัวช้ันเดียว
เซลลมลี ักษณะแบน แวควิ โอลขนาดใหญ เซลลเ รยี งตวั อดั แนน จนไมมชี อ งวางระหวา งเซลล ผนงั เซลลท่อี ยู
ดา นนอกมกั หนากวาผนังเซลลท่ีอยดู านใน มีควิ ทิน ( cutin )เคลอื บท่ีผนงั เซลล
2. พาเรงคมิ า (parenchyma) เน้ือเยื่อชนดิ นพี้ บไดท ว่ั ๆ ไปในพืช เซลลมีรปู รา งหลายแบบ ไดแ ก
คอ นขา งกลม รี หรอื รูปทรงกระบอก เม่อื เรียงตัวตดิ กันจงึ เกิดชอ งวางระหวางเซลล แวคิวโอลมขี นาดใหญ
เกือบเต็มเซลล พาเรงคมิ าทม่ี ีคลอโรพลาสอยูดว ย อาจเรยี กใหมว า คลอเรงคมิ า (chlorenchyma) ผนงั เซลล
ประกอบดว ยเซลลูโลส (cellulose)

3. คอลเลงคมิ า (collenchyma) เปนเนื้อเยื่อทีม่ ีเซลลรูปรางคลา ยคลงึ กบั พาเรงคิมา ผนงั เซลล

ประกอบดว ยเพกติน (pectin) และเซลลโู ลส ผนงั เซลลจะมคี วามหนาไมเ ทา กันโดยสวนหนามักอยตู ามมุม
เซลล พบเน้ือเย่อื ชนดิ นอี้ ยูตามกา นใบ เสน กลางใบ และในสว นคอรเ ทกซ (cortex) ของพชื ลม ลกุ คลอเรงคิมา
จะทําหนา ที่เพมิ่ ความแข็งแรงใหกับพืช
4. สเกลอเรงคิมา (sclerenchyma) เนอ้ื เย่ือชนิดน้ปี ระกอบดวยเซลลทมี่ ผี นงั หนามาก เพราะมีสาร
ลกิ นนิ (lignin) เคลือบผนงั เซลล จงึ เปน สวนท่ีทําใหพชื มีความแข็งแรง สเกลอเรงคมิ าประกอบดว ยเซลล 2
ชนดิ คอื ไฟเบอร (fiber) และสเกลอรีด (sclereid) ซ่งึ แตกตา งกนั ท่รี ปู รา งของเซลล
- ไฟเบอร เปนเซลลเ รยี งและยาว สว นสเกลอรีด เซลลม ีลักษณะสั้นกวาและมรี ปู รางตา งกัน
พบไดต ามสว นทีแ่ ข็งแรงของเปลอื กตนไม และเปลือกหมุ เมลด็ หรอื เนอื้ ผลไมส าก ๆ
2.2 เนื้อเยื่อถาวรเชงิ ซอ น (complex permanent tissue) ประกอบดว ยกลมุ เซลลห ลายชนดิ มาทาํ งานรว มกัน
ไดแก เน้อื เยือ่ ทอลําเลยี ง (vascular tissue) ซ่งึ ประกอบดว ย

1.ไซเลม (xylem)
เปนเน้ือเยอื่ ทที่ ําหนา ท่ลี ําเลียงนํ้าและแรธาตตุ าง ๆ ไปสสู วนตาง ๆ ของพชื ประกอบดว ยกลมุ เซลลท ีท่ ําหนาท่ี
หลักในการลําเลยี งน้ํา คอื
- เทรคดี (tracheid) เปน เซลลท ่ีมีรูปรางยาว ปลายคอนขา งแหลม ผนังเซลลหนามี สารพวกลิกนนิ สะสม เม่ือ
เซลลโตเต็มท่ีจะตาย โพรโทพลาสซึมสลายทาํ ใหเ กดิ ชอ ง ตรงกลางลําเลียงนาํ้ ไดด ี
- เวสเซล (vessel) มีขนาดใหญแตส ั้นกวา เทรคดี ประกอบดว ยเวสเซลเมมเบอร (vessel member) ซ่ึงเปน เซลล
ท่ีมผี นังหนามสี ารพวกลิกนนิ สะสม เซลลม ีรปู รางยาวหรอื สนั้ ปลายเซลลอาจเฉยี งหรือตรงและมชี อ งทะลุถงึ
กนั เวสเซลเมมเบอรห ลาย ๆ เซลลม าเรียงตอ กนั มลี กั ษณะคลา ยทอ นาํ้ เรียกวาเวสเซล

2.โฟลเอ็ม (phloem)
เปน เนือ้ เยอื่ ทที่ ําหนา ทลี่ าํ เลยี งสารอาหารทีใ่ บสงั เคราะหข นึ้ ไปสูสว นตา ง ๆ ของพชื ประกอบดว ยกลมุ เซลล
- ซีฟทวิ บเ มมเบอร (sieve tube member) มีรปู รา งเปน ทรงกระบอกยาว ท่ปี ลายผนังเซลลทง้ั 2 ดานจะมรี พู รนุ
เรียกวา
ซีฟเพลต (sieve plate) ซีฟทวิ บเมมเบอรห ลาย ๆ เซลลมาเรียงตอกันเรยี กวา ซีฟทวิ บ (sieve tube)
- คอมพาเนยี นเซลล (companion cell)

ตวั อยา งการเพาะเลยี้ งเนือ้ เยื่อ
การขยายพันธดุ าหลาโดยวธิ กี ารเพาะเล้ยี งเนอ้ื เย่ือ

นําหนอขา ง ท่ีแตกออกมาจากเหงาเดิม ซ่งึ ปลกู เลีย้ งไวในแปลงปลกู ตัดเอาหนอ ขางมีขนาดความ
กวา ง 3 ซม. ยาว 5 ซม. ออกจากเหงา ลางทําความสะอาดดว ยน้ําไหลเอาเศษดนิ ทต่ี ิดมาออกใหห มด
แลวจึงลางดว ยสบเู หลว พรอ มกับลอกกาบใบท่ีหมุ อยทู เี่ ปนแผล หรอื ทเี่ สียหายออกทิง้ ไป 2 - 3 ช้นั หลงั จาก

นัน้ ลา งดว ยนํ้ากลั่นอีกครง้ั แลวซับน้ําท่ีติดมาดว ยกระดาษทิชชู เม่ือแหง แลว ทาํ การฆาเชอ้ื ท่ีผิวนอกของหนอ
โดยเชด็ ดวยแอลกอฮอลเ ขมขน 70 เปอรเซน็ ต ใหทวั่ ท้ังหนอ หลังจากน้นั ทาํ การฆา เชื้อครัง้ ท่ี 2 โดยนาํ ไป
เขยา ในสารละลาย คลอรอ กซท่ีมคี วามเขม ขน 10 เปอรเซน็ ต เปนเวลานาน 15 นาที เมอื่ ครบเวลาจงึ
นาํ มาลางดว ยน้ํากลั่นท่นี ึ่งฆา เชอ้ื แลว 3 คร้ัง ทาํ ภายในตูปลอดเช้อื หนอ ทผี่ านการฆา เช้ือแลว มาตัดโดยเรม่ิ
จากการลอกกาบใบออกทลี ะช้ัน จนถึงสว นของปลายยอด (shoot tip) ตัดชนิ้ สวนใหม ีขนาด 0.5 x 0.5 ซม.
แลว นาํ ไปเลย้ี งบนอาหารวนุ สตู ร MS (1962) ท่ีเตมิ BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. เลีย้ งในหอ งเลี้ยงท่ใี ห
ความเขมแสงประมาณ 1,900 ลักซ เปนเวลานาน 16 ชั่วโมงตอ วัน อุณหภมู ิ 25 2 cํ หลังจากเลีย้ ง
เน้อื เยอื่ ไดนานประมาณ 60 - 80 วนั เรม่ิ แทงใบออกมาและคลอ่ี อก ยอดประกอบดว ยใบออ นทอ่ี ดั กันแนน
มีการพฒั นาขนาดใหญและมีใบจาํ นวนมากข้ึน

สําหรบั การขยายเพ่อื เพิ่มจํานวนตน สามารทาํ ไดโดยใชย อด (shootlet) ท่ีไดจ ากการเลี้ยง
เนอื้ เยอ่ื ในสภาพปลอดเช้อื โดยเลือกตน ทมี่ คี วามสมํ่าเสมอกันสูงประมาณ 4 ซม. และมใี บ 3 - 5 ใบ แลว
ตัดใบทิ้งโดยใหช นิ้ สว นบรเิ วณลําตนมีขนาดยาว 1 ซม. แลว ทาํ การผา แบงครง่ึ ตามแนวยาว นาํ ไปเลย้ี งบน
อาหารเหลวสตู ร MS (1962) ทเ่ี ติม BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. นานประมาณ 30 วนั โดยมีอตั ราการ
ขยายพนั ธุ 1 ชน้ิ สวน สามารถพฒั นาเปน ยอดได 2 - 3 ยอด โดยข้นึ อยูก บั จาํ นวนตาขา งของชิ้นสว น สามารถ
ทําการยา ยเปลีย่ นอาหารเพ่อื เพ่มิ จํานวน ควรทาํ การยายประมาณ 2 - 3 ครั้ง เนือ่ งจากเมอ่ื เลี้ยงในอาหารเหลว
เปน เวลานานจะทาํ ใหช ้นิ สว นหรอื ยอดมลี ักษณะฉาํ่ นา้ํ ใบมลี กั ษณะเปราะหักงา ยดงั นน้ั จงึ ควรทาํ การยายเลี้ยง
ขยายเพือ่ เพิม่ จาํ นวนโดยเลี้ยงบนอาหารวนุ สูตร MS (1962) ทเ่ี ตมิ BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. นานประมาณ
45 วัน

การชกั นาํ ใหเ กดิ ราก หลงั จากนัน้ เม่อื ยอดทเี่ ลย้ี งมีขนาดความสูงประมาณ 6 - 7 ซม. นาํ ยอด
มากระตุนใหเ กิดรากโดยยายยอดดาหลาทมี่ ีขนาดดงั กลา วเลย้ี งบนอาหารวนุ สูตร MS ที่ไมเตมิ สารควบคมุ การ
เจรญิ เตบิ โตพชื เลย้ี งนานประมาณ 30 วัน จงึ ทาํ การยายออกปลูก

สวนการยา ยตน กลา ดาหลาออกปลกู โดยนําตนกลาทีม่ รี ากแลว นาํ ตน กลามาลา งเอาเศษวนุ
ที่ติดมากับรากออกใหห มด แลว ทําการตดั รากออกใหมีขนาดความยาวประมาณ 1 - 2 ซม. แลวนาํ ไปปลกู ใน
ถุงพลาสตกิ สดี าํ ขนาด 2 x 4 นิว้ โดยใชว ดั สปุ ลูก คือ ทราย, ขเี้ ถา แกลบ และ ขุยมะพรา ว อตั ราสว นผสม 1
ตอ 1 ตอ 1 หลงั จากนน้ั นาํ ไปไวใ นแปลงพนหมอก เพาะชาํ นานประมาณ 1 - 2 เดือน จงึ ยา ยออกปลกู ลง
แปลงตอไป

ข้นั ตอนการขยายพนั ธดุ าหลาดวยวธิ กี ารเพาะเล้ยี งเนือ้ เยอ่ื
หนอขางที่แตกมาจากเหงา โดย
มีขนาด 3 x 5 ซม.

การชักนําใหเกดิ ยอดเม่ือเลี้ยงบนอาหารสูตร MS
ทเี่ ติม BAP 2 มก/ล. นาน 60 - 80 วัน

การเพ่ิมจาํ นวนยอดจาํ นวนมากเมอ่ื เลีย้ งใน
อาหารเหลวสตู ร MS ทเ่ี ตมิ BAP 2 มก/ล. นาน

30 วัน ในชวงแรก

การเพม่ิ จํานวนยอดจาํ นวนมากเมอื่ เล้ียงบน
อาหารสตู ร MS ทีเ่ ติม BAP 2 มก/ล. นาน 30 วนั

ในชวงหลัง

ยอดจํานวนมากเมื่อเลย้ี งในอาหารเหลวสตู ร MS
ไมท เี่ ตมิ สารควบคุมการเจรญิ เตบิ โตพืช นาน 30

วัน

การยายตน กลา ออกปลกู นาน 30 วนั