แบคทีเรียวิบริโอ (Vibrio spp) กับการเลี้ยงกุ้งขาวแวนนาไม-ดร.ธิดาพร-7สค63

แบคทเี รียวบิ ริโอ (Vibrio spp.)
กบั การเลยี้ งก้งุ ขาวแวนนาไม

ธิดาพร ฉวีภกั ด์ิ
นักวชิ าการประมงชานาญการพเิ ศษ
กองวิจยั และพัฒนาการเพาะเลีย้ งสัตว์นา้ ชายฝ่ัง

การตรวจสุขภาพกุ้งก่อนตดั สินใจใช้ยา

EMS/AHPND

Vp
c4
Vp3

+ve 897 bp Vp-flaE
+ve 500 bp Vp1 (C4)

+ve 360 bp EMS TUMSAT-Vp3 (Toxin gene) สารพิษ

อาการขีข้ าว (White feces Syndrome)

ATM

Gregarine Fungi Microsporidian Vibrio bacteria
Co-infection ??

การตดิ เชือ้ ร่วม

Chalor Limsuwan White feces
ลาไส้อกั เสบ
ATM
Chaweepack T., 2012
ChTaIDwAPeOeRpNaCcHkATW.,EE2P0A1CK6 www.themeCghaallewrye.ceopmack T., 2016

 ปัจจยั ท่เี ก่ียวข้องกับการเกดิ โรค

กุ้ง เชือ้ โรค

โรค

ปัจจัยแวดล้อม

การป้ องกันโรคกุ้ง ดีกว่าการแก้ไขหรือรักษาโรค

 ปัจจัยการเกดิ โรค

กุ้ง โรค เชือ้ โรค

ปัจจัยแวดล้อม

 เพ่มิ ความแขง็ แรงของระบบภมู คิ ุ้มกันกุ้ง

 สารอาหารท่ีครบถ้วน ไม่มีสารพษิ
 สารกระตุ้นภูมคิ ุ้มกัน ให้ก่อนเกดิ ภาวะอากาศเปล่ียนแปลง

3 – 5 วัน

ดร. จาเริญศรี ถาวรสุวรรณ

 ปัจจัยการเกดิ โรค

กุ้ง เชอื้ โรค

โรค

ปัจจัยแวดล้อม

 ป้ องกันและกาจัดเชือ้ ออกจากระบบ

 ลูกกุ้ง
 นา้
 อาหาร
 อุปกรณ์ เคร่ืองมือ
 คน
 พาหะ

ดร. จาเริญศรี ถาวรสุวรรณ

 ปัจจัยการเกดิ โรค

กุ้ง โรค เชือ้ โรค

ปัจจัยแวดล้อม

 มีระบบการจดั การการเลีย้ งท่ี
 คุณดภี าพนา้ เหมาะสม  ให้อาหารพอดี  การควบคุมปริมาณแบคทเี รียในระบบการเลีย้ ง

 มแี ผนการปฏบิ ตั งิ านในกรณีเกดิ การเปล่ียนแปลงของสภาวะแวดล้อมการเลีย้ งฉับพลัน
เช่น ฝนตกหนัก

ดร. จาเรญิ ศรี ถาวรสวุ รรณ

องค์ประกอบของการเกิดโรค

สภาพแวดล้อม สภาพแวดล้อม

สตั วน์ ้า โรค

สัตวน์ ้า เชื้อกอ่ โรค

เชือ้ ก่อโรค มาตรการปอ้ งกนั เชือ้ กอ่ โรคที่มปี ระสิทธิภาพ
(Biosecurity concept, plan, action, review)
ปรสติ
แบคทีเรีย 
ลดความเสยี่ งของการเกิดโรค
ไวรสั

ดร. จาเรญิ ศรี ถาวรสุวรรณ

หลักการในการปอ้ งกนั และควบคุมโรคสตั ว์น้า

ดร. จาเรญิ ศรี ถาวรสวุ รรณ  ตวั สัตว์ (กุ้ง)
• ตรวจสุขภาพและโรคก่อนปล่อย
• ทดสอบความแขง็ แรง
• สายพนั ธุโ์ ตไว
• ภูมคิ ุ้มกนั ดี

 ตวั เชือ้ (ปรสิต แบคทีเรีย ไวรัส เชือ้ รา)
• ป้องกันพาหะนาเชอื้
• ฆ่าเชือ้ นา้ ดนิ
• โปรแกรมตัดเชอื้ ระหว่างเลยี้ ง

 สภาวะแวดลอ้ ม (น้า ดนิ )
• รักษาสมดลุ น้าในบอ่
• ความหนาแน่นเหมาะสม
• การปรับอาหารประจาวนั

หลักการในการปอ้ งกนั และควบคุมโรคกุง้

บ่อสกปรก ปรสิต  ถ่ายนา้ –ใหก้ ุ้งลอกคราบ
 อาหารเหลือ แบคทเี รีย  ใช้จลุ นิ ทรียย์ ่อยสารอนิ ทรยี ์ –
ไวรัส ปรบั ให้บ่อสะอาด
 ซากแพลงค์ตอน
 ใช้จลุ ินทรีย์-ลดเช้ือแบคทเี รยี
ชนิดไม่ดี (โคโลนีเขียว)
 ใชย้ าทอี่ นุญาต ขึ้นทะเบยี น

 ไมม่ ยี ารักษา
 เน้นการป้องกนั

- กาจัดพาหะ
- ตรวจลูกกุ้ง

ดร. จาเรญิ ศรี ถาวรสุวรรณ

โรคกุ้งทะเลท่สี าคญั

โรคเกดิ จากเชอื้ โรคเกดิ จาก โรคเกิดจาก โรคเกิดจากอาหาร,
เชอื้ โปรโตซัว
โรคเกิดจากเชอื้ ไวรัส แบคทเี รีย เชอื้ เชอื้ รา สารพษิ และ

1. ดวงขาว White spot 1. เรืองแสง Luminous 1. เชือ้ ราในลกู ก้งุ 1. โปรโตซวั ภายนอก ส่งิ แวดล้อม

disease (WSD) Bacterial Disease (Larval Mycosis) (Ciliate Infestation) 1. อาการเปลือกบาง
2. หวั เหลือง Infection with 2. เปลือกมีแผลดา 2. ไมโครสปอริดิโอซสิ
(Chronic Soft-shell
yellow head virus Shell Disease (Microsporidiosis) Syndrome)
3. ทอร่า Taura syndrome 3. แบคทีเรียเส้นใย 3. กรีการีน (Gregarine 2. ตวั สีฟ้ า (Blue shell
Syndrome)
(TS) Filamentous Infestation) 3. กล้ามเนือ้ ตายขาวข่นุ
4. กล้ามเนือ้ ตาย Infectious
Bacterial Disease (Muscle Necrosis)
4. วบิ ริโอซิส Vibriosis 4.อ า ก า ร เ ก ร็ ง เ ป็ น ต ะ ค ริ ว
myonecrosis (IMN)
5. แคระแกร็น Infectious 5. Necrotising (Cramped Tails, Bent
hepatopancreatiti Tails, Body Cramp)
hypodermal and
s (NHP)
haematopoietic 6.
necrosis (IHHN) disease ตบั วายเฉียบพลัน

Acute

Hepatopancreatic

Necrosis Disease

(AHPND)/EMS

อาการขีข้ าว

Marine shrimp diseases:
CAUSED BY PROTOZOANS (โปรโตซัว)

GREGARINES MICROSPORIDIA EPICOMMENSALS CILIATES

กรีการีน

Nematopsis sp.

Nematopsis sp. was found troughout the year 13

EPICOMMENSALS: CILIATE PROTOZOANS

• These organisms can cause high mortality in larvae & juveniles when they
attack their gills.
• The abundance of ciliates in shrimp may indicate high density of bacteria,
high organic matter concentration and/or poor water quality.

Treatment for ciliates attack
• To control protozoans in shrimp hatcheries, formalin (30 ppm) is applied
with strong aeration for 1 hour. This process is repeated the next 3 days.

• In shrimp farms water exchange should be improved, feed dose reduced
and aeration increased.

Vorticella Zoothamnium

Epistylis

Acineta

Ascophrys

Photos: L. Vinatea

เกดิ จากเชือ้ ปรสติ ในกลุ่มไมโครสปอริเดีย

Agmasoma penaei

EHP spore

ศพช.จนั ทบรุ ี

EHP spore Melanization ในตบั ก้งุ Chaweepack T., 2016

EHP mature spores were oval
and a posterior vacuole

EHP สปอร์ในตบั ลูกกงุ้ PL 13 EHP สปอร์ ย่อมตดิ สีชมพู

ศพช.จนั ทบรุ ี Melanization ในตบั กุ้ง

TIDAPORNCChHaAWwEeEePApCaKck T., 2016

Deseases of Marine Shrimp:

เช้ือรา

LARVAL MYCOSIS Lagenidium sp. Fusarium sp.

Sirolpidium sp.

โรคเกดิ จากเชื้อไวรัสในก้งุ ทะเล

โรคตัวแดงดวงขาว (WSD)

โรคหวั เหลือง (YHD)

โรคทอร่า (TS)

โรคแคระแกร็น (IHHN)

โรคกล้ามเนือ้ ตาย (IMN)

โรคเกดิ จากเชื้อแบคทีเรีย

Shrimp with vibriosis Shตrบั iวmายpฉบั wพiลtนัhENMHSP/AHPND

Gill fouling and discoloration

ตบั อกั เสบ NHP

ก้งุ ปกติ โรคดา่ งขาว WPD

ตบั อกั เสบ NHP โรคจดุ ดา่ งขาว White Patch Disease (WPD)

แบคทเี รีย

VIBRIOSIS IN LARVICULTURE OF MARINE SHRIMP

• Luminescent vibrio in larviculture: Vibrio harveyi
• They colonize the anterior digestive tract of shrimp larva, then they spread all over

• Also there is a massive colonization of appendages in larvae.
• They cause the “Zoea 2 Syndrome”. Little white spheres are formed from HP cells.
• Ability to gain resistance to antibiotics, that is why probiotics are commonly used.

Colonization of appendages White spheres (Bolitas)

Photos: Lightner D.V. 1996
Chanratchakool et al. 1995.Health management in shrimp ponds

ปรสิตภายนอกและแบคทเี รียเส้นใย

ข้อมูลผลการตรวจคุณภาพลูกกุ้งตามเกณฑ์กรมประมง พ.ศ. 2556

บอ่ ดนิ

พบวา่ ก้งุ กลมุ่ ที่ไมเ่ ป็น EMS มีคะแนนประเมินสขุ ภาพเมื่อเป็นลกู ก้งุ รวมทงั้
ความสมบรู ณ์ของตบั ทางกายภาพ สงู กวา่ กลมุ่ EMS อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติ

ลกั ษณะตบั และตบั อ่อนผดิ ปกติของกงุ้ ขาวจากบ่อดิน

ตบั ฝ่ อในก้งุ เลี้ยงบ่อดิน 12 วนั

VIBRIOSIS IN THE GROWOUT PHASE

Spotted shrimp Shrimp with white feces

Photo.: D. Lightner photos.: Ch. Limsuwan
P. chanratchakool

Bacteria in Tissue

Photo: B. Gómez Gil

VIBRIOSIS IN MARINE SHRIMP CULTURE

SEAGULL SYNDROME
• Erratic swim of shrimp to the surface of water; lethargy; anorexia; expanded chromatophores

(red appendages).

• CAUSED BY: TCBS green colonies like, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. harveyi. Also yellow
colonies like, V. alginolyticus

• Lethal levels: 10x10² CFU/ml in hemolymph y 10x10³ CFU/gr in Hepatopancreas

Ref.: B. Gómez Gil 2005

โรค วบิ ริโอซสิ VIBRIOSIS

สีโคโลนีแบคทเี รียวิบริโอบนอาหารเลีย้ งเชือ้ TCBS ชนิดของแบคทเี รียวิบริโอ

(TCBS; Thiosulphate citrate bile salt agar) (POSSIBLE SPECIES OF VIBRIO)

สีเหลือง Yellow (rarely pathogenic) V. alginolyticus, V. parahaemolyticus (10%)

สีเขียว Green (highly pathogenic) V. vulnificus, V. parahaemolyticus (AHPND)

เรืองแสง Luminiscent (highly pathogenic) V. harveyi , V. parahaemolyticus

No growth in TCBS agar V. peneicida (highly pathogenic)

Ref.: Morales & Cuellar 2008 // B. Gómez Gil 2005 By: Carlos A. Ching

Luminescent vibrio โคโลนีสีเหลือง Yellow colonies ใน TCBS agar โคโลนีสีเขยี ว Green colonies
ใน TCBS agar
วบิ ริโอเรืองแสง

แบคทีเรียวิบริโอ คือ

• วิบริโอ เป็ นเชือ้ แบคทีเรียที่อาศยั อยใู่ นนา้ เค็ม มีหลายสายพนั ธ์ุ สว่ นมากเป็ น
เชือ้ ประจาถ่ินท่ีอาศยั อยใู่ นสงิ่ แวดล้อมและในสตั ว์นา้ เค็ม

• เป็ นเชือ้ แบคทีเรียแกรมลบ รูปร่างแทง่ โค้ง ชอบความเคม็ ต้องการเกลือใน
การเจริญเตบิ โต (≥10‰ = ≥1%)

• ไมเ่ ติบโตที่ พีเอช ตา่ กวา่ 5 หรือสงู กวา่ 11
• ไมส่ ร้างสปอร์ ไม่สร้างแคปซลู ทาลายได้ด้วยความร้อน
• หลายชนิดเป็ นเชือ้ ประจาถ่ินในทางเดนิ อาหารของก้งุ ทะเล บางชนิดเป็ นเชือ้

ฉวยโอกาส ก่อโรคเฉพาะเมื่อสตั ว์เครียด และสิง่ แวดล้อมไม่เหมาะสม
• บางสายพนั ธ์เุ ป็ นเชือ้ กอ่ โรคในสตั ว์ทะเล เชน่ Vibrio alginolyticus,

V. harveyi, V . parahaemolyticus



แบคทีเรียวบิ ริโอ คือ

• อาหารเลยี ้ งเชือ้ TCBS สามารถใช้แยกสายพนั ธ์ุ Vibrio ได้เบอื ้ งต้น
โดยอาศยั หลกั การใช้ Sucrose ของเชือ้ Vibrio โดย colony สี
เหลอื ง สามารถใช้ Sucrose ได้ และ colony สเี ขียวคือไมส่ ามารถ
ใช้ Sucrose ได้

• บางชนิดสามารถสร้างสารเรืองแสงได้

• สารพิษ สว่ นมากสร้าง toxin ชือ้ toxR เป็ นหลกั
• ถ้าเป็น AHPND strain สร้างสารพิษ pir-A pir-B toxin

แบคทีเรียวบิ ริโอ คือ

• มีทงั้ Endotoxin และ Exotoxin
• แตห่ ลกั ๆเป็น Endotoxin จาก lipopolysaccharide บนผนงั แบคทเี รีย
แกรมลบ
• วบิ ริโอเข้าไปในทางเดนิ อาหาร แล้วก็ colonize เพ่มิ จานวนในทางเดนิ อาหาร
• มี quarum sensing เรียกพวกเข้ามาเกาะเพม่ิ เติม
• มีการสร้าง biofilm ป้ องกนั ตวั เองจากกรด และสารอ่ืนๆ
• พวก toxin กจ็ ะถกู สร้างในขณะที่วิบริโอ colonize และเพ่ิมจานวนนน่ั เอง
• โดยทวั่ ไป กระต้นุ ให้เกิดการอกั เสบครับ แล้วพอมกี ารอกั เสบมากๆ ก็สง่ ผลให้เกิดความ

เสียหายกบั เซลล์ได้ครับ

โรคตับอักเสบ เกดิ จากเชือ้ แบคทเี รียกลุ่มวบิ ริโอ Vibrio spp.

ระยะความรุนแรงของโรคตับอักเสบ เกดิ จากเชือ้ แบคทเี รียกลุ่มวบิ ริโอ Vibrio spp.

ระยะท่ี 0 ยงั ไม่แสดงอาการตดิ เช้ือ ระยะที่ 1 ท่อตบั เริ่มผดิ ปกติ และ เริ่มอักเสบ ระยะที่ 2 ท่อตับรูปท่อผิดปกตเิ พ่มิ ข้นึ เร่ิมมี
เลก็ น้อย การตาย ถ้าไม่มีการรักษา

ระยะที่ “3”Melanisation, มีการอักเสบมากข้นึ การ ระยะท่ี “4” ท่อตับมีการอักเสบแผลสีดารุนแรง ระยะสุดท้าย
ตายมากข้นึ - High mortality มีการตายสูง

Vibrio – Examples of Species

Sucrose (TCBS) Luminescence

V. parahaemolyticus* – –
+/(– rare)
V. harveyi* –/(+ rare) +/(– rare)
–
V. vulnificus* –/(+ rare) –
–
V. penaeidcida* –

V. alginoticus* +

V. fluvialis +

*Some pathogenic strains; + = yellow colony; – = green colony

TCBS plates for estimating TCBS Agar – yellow
ration of Vibrio sp. based on
sucrose utilization:
• Yellow = utilize
• Green = do not

Vibrio parahaemolyticus - green

Vibrio fisheri Luminescence – in dark

Ambient light

Vibrio parahaemolyticus สายพนั ธ์ุก่อโรค
EMS/AHPND

• ความรุนแรงเกิดจากพลาสมิดท่อี ย่ใู นเซลล์ของแบคทเี รีย VP
• สร้างสารพษิ
• ตรวจวนิ ิจฉัยโรค EMS/AHPND โดยวิธี PCR นีใ้ ช้ไพรเมอร์ท่ี
ออกแบบมาจากพลาสมิดน่ันเอง

VpVp

EMS

V. parahaemolyticus

1.แบคทเี รยี แกรมลบ

2. รปู ทอ่ นตรงหรอื โคง้ เล็กนอ้ ย

3. ไมส่ รา้ งสปอร์ ไมส่ รา้ งแคปซลู

4. อณุ หภมู ทิ เี่ หมาะสมตอ่ การเจรญิ 35-37 °C

5. ชว่ งความเป็ นกรดดา่ ง(pH) ในการเจรญิ 5 - 11

6. ตอ้ งการเกลอื ในการเตบิ โตประมาณ 10-30 ppt
(0.5-80ppt)

7. เจรญิ ไดใ้ นชว่ งอณุ หภมู ิ 9.5- 45 °C

8. การแพรก่ ระจายของเชอื้ ขน้ึ อยกู่ บั อณุ หภมู ิ เชอื้ อยใู่ นตะกอนดนิ
ช9.ว่ งเมออื่ณุ อหณุ ภหมู ภติ มูา่ สิ งู เชอ้ื จะแพรจ่ ากตะกอนพน้ื น้าหรอื พน้ื บอ่ สแู่ พลงคต์ อน
สตั ว์ และยอ่ ยไคตนิ สว่ นเปลอื กของแพลงคต์ อนสตั วเ์ ป็ นอาหาร
10. เชอื้ ถกู ทาลายทอี่ ณุ หภมู ิ 60 °C ในเวลา 15 นาที
11. ถกู ทาลายดว้ ยกรดมะนาว pH 4.4 ในเวลา ประมาณ 30 นาที
12. เชอ้ื จะตาย ทร่ี ะดบั เกลอื โซเดยี มคลอไรด์ มากกวา่ 10%
13. สามารถอยไู่ ดท้ อ่ี ณุ หภมู ติ า่ เชน่ ในเนอื้ ปู (1-15 °C) นาน 30 วนั ,
กงุ ้ ปอกเปลอื ก (3-18 °C) นาน 6 วนั , หอยนางรมแชแ่ ข็งนาน 40-130 วนั
14. เชอื้ จะเพมิ่ จานวนเป็ นเทา่ ตวั ทกุ ๆ 10 ถงึ 15 นาที ทอ่ี ณุ หภมู ิ 37°C

ที่มา ผศ.ดร.พิมพเ์ พญ็ พรเฉลิมพงศ์

Vibrio parahaemolyticus (AHPND)

• สายพนั ธ์ทุ ่รี ุนแรง
• สง่ิ แวดล้อม; นา้ , ไบโอฟิ ล์ม, เลน, แพลงก์ตอน
• การตดิ ตอ่ จะผา่ นทางการกิน

• กระเพาะอาหาร (ST) และลาไส้ (MT ) ว่าง
• ตบั (HP) ซีด

• เกาะและเจริญเตบิ โตในกระเพาะอาหารก้งุ
• สง่ สญั ญาณผา่ นระบบ quorum sensing
• ผลติ สารพิษ

ที่มา น.สพ.สวุ รรณ ยมิ ้ เจริญ

การศึกษาการเพ่มิ จานวนของแบคทเี รียวบิ ริโอ (Vibrio spp.) ชนิดต่างๆ ในอาหารกุ้ง

VpEMS/AHPND Vibrio harveyi V. alginolyticus

พบว่า VpEMS/AHPND เจริญเตบิ โตในอาหารกุ้งได้ดมี ากกว่าแบคทเี รียวบิ ริโอชนิดอ่นื ๆ

VP อยู่ท่ไี หน ?

5 อากาศ

2 ไบโอฟิ ล์ม 3 แพลงก์ตอน

1 นา้

4 เลน ที่มา น.สพ.สวุ รรณ ยมิ ้ เจริญ

ปัจจยั เหนี่ยวนาการเกิด EMS

1. สายพนั ธรุ ์ นุ แรง
2. ความเค็ม และ สารอนิ ทรยี ์

1. ขนาดของกงุ้ แบคทีเรียวิบริโอ 1. ระบบฺ ความปลอดภยั ทางชวี ภาพ
Biosecure
(VP EMS/AHPND)
2. อณุ หภมู ิรอบวนั
EMS 3. คณุ ภาพนา้ ตา่ งๆทีเ่ ปลี่ยนแปลง

Shrimp Environment

ท่ีมา น.สพ.สวุ รรณ ยมิ ้ เจริญ

Level 2.2: การเพาะเลีย้ งเชือ้ แบคทเี รีย (Bacterial culture)
PLATE COUNTING METHOD
Sample Preparation

การเตรียมตวั อย่าง

Diluting the sample
การเจือจางตัวอย่าง

Plating the sample
(Spread or Streak plate)

การเกล่ีย หรือ เข่ีย ตัวอย่าง ให้ท่วั ผิวหน้าเพลท

Counting bacterial colonies

การนับจานวนโคโลนีแบคทเี รีย

Calculated the number of colony forming units
การคานวณจานวนโคโลนีแบคทเี รีย
TIDAPORN CHAWEEPACK

Vibrio parahaemolyticus on TCBS and CHROMagar

TCBS agar

V. parahaemolyticus
สีม่วงน้าเงนิ

CHROMagar

TIDAPORN CHAWEEPACK

Vibrio Colonies on TCBS agar
and CHROMagar

V. vulnificus สีเขียวฟ้ า

V. parahaemolyticus

TCBS agar Vp มสี ีเขียว Chrom agar Vp มสี ีม่วงชมพู สีม่วง สีม่วงนา้ เงนิ

ตรงกลางโคโลนีมสี ีเขียวเข้ม TIDAPORN CHAWEEPACK

ลกั ษณะสีโคโลนขี องแบคทเี รียวิบริโอใน CHROMagar

TIDAPORN CHAWEEPACK

ลกั ษณะโคโลนี V. parahaemolyticus
ในอาหาร TCBS

TIDAPORN CHAWEEPACK

TIDAPORN CHAWEEPACK

เปรยี บเทียบลกั ษณะโคโลนี V. parahaemolyticus

กบั Vibrio ชนิดอืน่ ในอาหาร TCBS

V. vulnificus V. harveyi

V. parahaemolyticus

V. vulnificus

V. vulnificusTIDAPORN CHAWEEPACK

ลกั ษณะสีโคโลนีของแบคทีเรียวบิ ริโอใน CHROMagar

Vibrio alginolyticus สีขาว
V. cholerae และV. vulnificus สเี ขยี ว
V. parahaemolyticus สมี ว่ ง มว่ งนา้ เงิน

TIDAPORN CHAWEEPACK

ลกั ษณะสโี คโลนขี องแบคทเี รียวบิ ริโอVpEMS/AHPND ใน CHROMagar

TIDAPORN CHAWEEPACK