รายงานประจำปี 2563

46

เอกสารเผยแพรสำหรับใหบ รกิ ารประชาชน

47
การใหบ รกิ ารความรูดา นกฎหมายและระเบยี บสำหรับประชาชน

48
การเผยแพรองคความรใู นรูปแบบ Infographic

นำเสนอขอมูลในรูปแบบสื่อ Infographic เพื่อใหมีเนื้อหากระชับ เขาใจงาย และนาสนใจ
สำหรับนำเสนอขอมูลในเว็บไซต และสงตอผานสื่อสังคมออนไลนไดสะดวกรวดเร็วยิ่งขึ้น โดยสื่อ Infographic
ที่มีการเผยแพรทางเว็บไซตแลว ไดแก ขั้นตอนการขอรับบริการตรวจวินิจฉัยสัตวน้ำ ขอควรปฏิบัติสำหรับ
สถานประกอบการสงออกสัตวน ้ำในสถานการณโรคระบาด covid-19 ยาและเคมีภัณฑท ห่ี า มใชในการเพาะเลี้ยง
กงุ ทะเล ข้ันตอนการออกหนังสอื รับรองสขุ ภาพสตั วน ำ้ ในสถานการณโ รคระบาด covid-19 เปนตน

49

50

การใหบ รกิ ารดา นสขุ ภาพสัตวน ้ำ

51

52

สถิติผเู ขาชมเวบ็ ไซตกองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน ำ้

จาํ นวนผูเขาชมเวบ็ ไซต เดือนมกราคม - ธนั วาคม 2563 (คน)

700
600
500
400
300
200
100

0 ม.ค. ก.พ. มี.ค. เม.ย. พ.ค. ม.ิ ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย. ต.ค. พ.ย. ธ.ค.
จํานวน(คน) 499 125 100 312 206 375 318 618 288 348 259 302

ผลที่ไดจากสถิติการเขาชมเว็บไซตกองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน้ำ ตั้งแตเดือนมกราคม จนถึงเดือน
ธันวาคม 2563 มียอดการเขาชมสะสมทั้งสิ้น 3,750 ครั้ง โดยเดือนที่มีการเขาชมมากที่สุด คือ เดือนสิงหาคม
2563 อยูที่ 618 ครั้ง และเดือนที่มีการเขาชมนอยที่สุด คือ เดือนมีนาคม 100 ครั้ง ซึ่งเนื้อหาที่มีการรับชม
มากท่ีสุด 5 อันดบั บนเว็บไซต ไดแก งานวจิ ัย กฎหมายและระเบียบตา ง ๆ ทเ่ี กี่ยวขอ ง เอกสารเผยแพร หองสมุด
งานวจิ ยั และบทความนา รู ตามลำดบั

53

ผลของบัวบก (Centella asiatica) ตอ ภมู คิ มุ กันแบบไมจ ำเพาะและความตานทาน
เชอื้ สเตรปโตคอคคสั (Streptococcus sp.)

ในปลากะพงขาว (Lates calcarifer Bloch, 1790)

นางสาวเจนจติ ต คงกำเนิด*1 นางจไุ ลวรรณ รงุ กำเนดิ วงศ2 และ นางจำเริญศรี ถาวรสุวรรณ3
1ราชการบริหารสว นกลาง 2สำนักงานประมงจังหวดั ปต ตานี 3ศนู ยว จิ ัยและพฒั นาสขุ ภาพสัตวน ้ำสงขลา

รหัสทะเบียนวจิ ัย 54-0308-53052-008

บทคดั ยอ

ศึกษาผลของบัวบก (Centella asiatica) ที่เสริมในอาหารตอภูมิคุมกันแบบไมจำเพาะและความ
ตา นทานเช้อื สเตรปโตคอคคสั (Streptococcus sp.) ในปลากะพงขาว (Lates calcarifer Bloch, 1790) วยั รนุ
ทีเ่ ลย้ี งในถงั 500 ลิตร จำนวน 9 ถงั แบงเปน 3 ชดุ การทดลอง โดยใหอ าหารเม็ดท่ีเคลือบบัวบกแหงบดละเอียด
ซึ่งมีปริมาณบัวบก 3 ระดับ คือ 0%, 2.5% และ 5.0% เปนระยะเวลา 3 สัปดาห เมื่อตรวจวิเคราะหภูมิคุมกนั
ของปลากะพงขาวแตละชุดหลังใหอาหารเปนเวลา 1, 2 และ 3 สัปดาห พบวาไลโซไซม ไมแตกตางกันทาง
สถิติ แตการจับกินสิ่งแปลกปลอมในปลากะพงขาวที่ใหอาหารเคลือบบัวบก 2.5 และ 5.0% สูงกวาปลาชุด
ควบคุมอยา งมนี ัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) ในขณะที่ความตานทานเชื้อ Streptococcus agalactiae ของปลา
กะพงขาวที่ใหอาหารเคลือบบวั บก 2.5 และ 5.0% มีแนวโนม สงู กวา ปลาชุดท่ีไดร ับอาหารท่ีไมเสริมบัวบกแตไม
มีความแตกตางทางสถิติ ผลการศึกษาแสดงใหเห็นวาการใหอาหารเสริมบัวบก ที่ระดับ 2.5 และ 5.0% เปน
ระยะเวลา 2 และ 3 สัปดาห สามารถกระตุน ภูมคิ มุ กนั แบบไมจ ำเพาะใน ปลากะพงขาว

คำสำคญั : บัวบก, ปลากะพงขาว, สเตรปโตคอคคสั , ภมู คิ ุมกนั

______________________________________________________________________________
*ผูรับผดิ ชอบ: 50 ถ.พหลโยธิน เกษตรกลาง แขวงลาดยาว เขตจตจุ ักร กรุงเทพฯ 10900 โทร. 02 579 4122

E-mail: [email protected]

54

Effect of Asiatic Pennywort (Centella asiatica) on Non-specific Immune
and Resistance of Streptococcus sp. in Seabass,
Lates calcarifer, Bloch (1790)

Janejit Kongkumnerd*1, Julaiwon Rungkamnerdwong2 and Jumroensri Thavornsuwan2
1Central Administration, 2Pattani Fisheries Provincial Office,

3Songkhla Aquatic Animal Health Research and Development Center
Abstract

Study on the effect of Asiatic pennywort (Centella asiatica) to the non-specific immune
and the resistance of Streptococcus sp. in juvenile Seabass, Lates calcarifer Bloch (1790) were
evaluated. The fish were separated into three experimental groups and rearing in the 500-L tank.
Each group consisting of triplicate and was fed with diet supplemented with Asiatic pennywort
in 3 different doses, which are 0% (control), 2.5% and 5.0%, respectively for 3 weeks. Fish were
sampled at 1, 2 and 3 weeks after feeding to observe the non-specific immune responses. The
results showed that there was no significant difference in lysozyme level in all time of
observation. On the other hand, the phagocytosis of fish fed with 2.5 and 5% Asiatic pennywort-
coated diet showed significantly higher than the control group (P<0.05). Moreover, fish fed with
2.5% and 5.0% Asiatic pennywort-coated diet showed higher resistance to Streptococcus
agalactiae with no significant difference, compared with the control group. In conclusion, the
2.5 and 5.0% Asiatic pennywort-supplemented diet could induce fish immune response after
feeding for 2 and 3 weeks.

Keywords: Asiatic pennywort, Centella asiatica, Seabass, Lates calcarifer, Streptococcus,
immune

________________________________________________________________________________
*Corresponding author: 50 Paholyothin, Lad Yao, Chatuchak, Bangkok 10900

Tel. 02 579 4122, E-mail: [email protected]

55

บทนำ

ปลากะพงขาว (Lates calcarifer Bloch (1790)) เปนปลาทะเลที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจของ
ประเทศไทย ซึ่งเกษตรกรนิยมเลีย้ งในกระชังตามแหลงน้ำธรรมชาติมากวา 50 ป แตในปจจุบันแหลงน้ำมีความ
เสื่อมโทรมลงเต็มไปดวยมลภาวะตางๆ ทั้งเชื้อโรคที่เพิ่มขึ้น คุณภาพน้ำที่เสื่อมโทรมลง สารอินทรียและสาร
ปนเปอนอืน่ ๆ นอกจากนั้นรูปแบบการเล้ียงในปจจุบันท่ีพัฒนาเปนการเลี้ยงในความหนาแนน สงู ทำใหมีโอกาส
ที่ปลาจะสัมผัสกับเชื้อโรค เกิดความเครียด และออนแอ สาเหตุเหลานี้มีสวนโนมนำใหเกิดโรคไดงายยิ่งขึ้น
โดยเฉพาะโรคตดิ เชอื้ Streptococcus ซึ่งมีแนวโนมทจ่ี ะมกี ารระบาดมากขนึ้ รวมท้ังแพรกระจายไปยังปลาหลาย
ชนิดและทำใหเกิดความสูญเสยี ทางเศรษฐกิจ เชอ้ื Streptococcus ซึ่งเปน แบคทีเรียทมี่ ีรปู รางกลม ชนิดแกรม
บวก ทำใหเกิดโรคทั้งในปลานำ้ จืด เชน ปลานิล (นเรศและคณะ, 2548) ปลาหางนกยูง และปลากัด (วีณา และ
คณะ 2550) และในปลาทะเล เชน ปลากะพงขาว (สถาพร และเยาวนิตย, 2530; เยาวนิตย และคณะ, 2543;
เฉลมิ และคณะ, 2548) และปลาชอ นทะเล (จริ าพร และคณะ, 2551)

ในปจจุบันทั่วโลกมคี วามพยายามทีจ่ ะหลีกเลีย่ งการใชยาและสารเคมีสังเคราะหใ นการปอ งกัน บำบัด
และรักษาโรค เนื่องจากกอใหเกิดปญหาสารตกคา งในสัตวน้ำซึ่งเปน อันตรายตอผูบริโภค และการตกคางของยา
และสารเคมีในแหลงน้ำซึ่งเปน การทำลายสิ่งแวดลอ ม แนวทางหนึง่ ท่ีมีความเปนไปไดค ือการนำพชื สมุนไพรไทย
มาประยุกตใชในการปองกันและควบคุมโรค ไดแก บัวบก (Centella asiatica) ซึ่งเปนพืชสมุนไพรชนิดหนึ่งที่
นาสนใจเพราะมีรายงานถึงสรรพคุณทางยา และมีฤทธิ์ตานเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus (สำนักงานขอมูล
สมุนไพร, 2551) รวมทงั้ หาไดง ายโดยพบอยทู วั่ ไปในประเทศไทย ผวู จิ ยั จึงดำเนนิ การศกึ ษาประสิทธิภาพของสาร
สกัดจากบัวบกในการสรา งเสริมภูมคิ ุม กันในปลากะพงขาวและความตา นเชื้อ Streptococcus เพื่อนำไป ใชใน
การปองกันและควบคุมโรคติดเชื้อ Streptococcus ซึ่งเปนแนวทางที่ไมกอผลกระทบตอสภาพแวดลอม
สามารถลดปญหาการใชยาปฏชิ วี นะและทำใหอุตสาหกรรมการเพาะเลย้ี งสัตวน ำ้ พัฒนาไดอ ยางยง่ั ยืน

วัตถปุ ระสงค
เพื่อศึกษาปริมาณบัวบกที่เหมาะสมสำหรับผสมอาหารเพื่อกระตุนภูมิคุมกันและตานทานเชื้อ
Streptococcus ในปลากะพงขาว

วิธีดำเนินการ

1. การวางแผนการทดลอง
ดำเนินการทดลองทศี่ ูนยว จิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน้ำสงขลา ในชวงเดอื น มกราคม 2554 - กันยายน

2555 วางแผนการทดลองแบบสุมตลอด

56

2. วิธีทดลอง
2.1 เตรียมบัวบก
นำใบบัวบกมาลางและผึ่งแดดใหแหง นำไปอบแหงที่อุณหภูมิประมาณ 50o C แลวบดให

ละเอยี ด ใสถงุ พลาสตกิ ปดปากถงุ ใหแนน เเกบ็ ในทีแ่ หงและเย็น
2.2 เตรียมเชือ้ แบคทีเรยี
เชอ้ื ที่ใชในการศึกษาคือ Streptococcus agalactiae ทแี่ ยกไดจ ากจากตบั และไตของปลากะพง

ขาวปวย แลวถายเชื้อใหไดเชื้อบริสุทธิ์ นำมาทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีแลวแยกชนิด โดยใชชุดทดสอบ
api 20 strep (สำหรับแยกเชื้อสกุล Streptococcus) แลวแยกชนิดดวยโปรแกรมสำเร็จรูปในเว็บไซต
http://apiweb.biomerieux.com และยืนยันการกอโรคของเชื้อที่แยกไดโดยฉีดเชื้อดังกลาวเขาสูปลาปกติ
เมื่อยืนยันการกอโรคแลวเก็บเช้ือที่กอโรคไวใ นอาหาร Nutrient Broth ผสม Glycerol 15% เก็บไวในตูแชแขง็
–80o C

2.3 ศึกษาผลของผงบัวบกแหง ตอการตอบสนองของภมู คิ ุม กนั
วางแผนการทดลองแบบสุมตลอด โดยใชผงบัวบกแหงเคลือบบนอาหารเม็ดสำเร็จรูปสำหรับ

ปลากะพงขาวกนิ โดยมปี รมิ าณผลบัวบกแหง 3 ระดับ คอื 0, 2.5, และ 5.0%
ปลากะพงขาวที่ใชในการทดลองมีสุขภาพแข็งแรงและไมมีอาการปวย นำมาเลี้ยงเพื่อปรับ

ใหคุน เคยกับสภาพแวดลอมที่ศนู ยวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสตั วน้ำสงขลา เปนเวลา 14 วัน คดั เลือกปลาท่ีมีขนาด
ใกลเคียงกันจำนวน 315 ตัว มีน้ำหนักเฉลี่ย 22.6±2.1 กรัม ใสในถังทดลองขนาด 500 ลิตร จำนวน 9 ถังๆ ละ
35 ตัว แบงเปน 3 ชุดการทดลอง ตามปริมาณสารสกัดบัวบกที่ผสมในอาหาร 3 ระดับ เลี้ยงปลาทดลองเปน
ระยะเวลา 3 สัปดาห แลวสุมเก็บตัวอยางปลาทกุ สัปดาห ทุกถังๆ ละ 10 ตัว เพื่อใชตรวจสอบภูมิคุมกันจำนวน
4 ตัว โดยเก็บเลือดและไตสวนหนาของปลาเพื่อวิเคราะหประสิทธิภาพของไลโซไซม และการจับกิน
สิง่ แปลกปลอม สว นปลาตัวอยา งอีก 6 ตัว ใชใ นการทดสอบความตานทานตอ เชอื้ Streptococcus

2.4 ศกึ ษาความตานทานเชื้อ Streptococcus
นำปลาทดลองที่เลี้ยงครบ 1, 2 และ 3 สัปดาห มาทดสอบความตานทานเชื้อแบคทีเรียถังละ

6 ตัว จำนวน 9 ถัง นำมาใสในตูกระจกขนาด 30 ลิตร จำนวน 9 ตู โดยใชเชื้อ S. agalactiae ที่เก็บไวในตู
แชแข็ง -80๐ C นำมาเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Triptic Soil Agar (TSA) บมไวในตูบมเชื้อ ที่อุณหภูมิ 30o C
นาน 18-24 ชั่วโมง รวบรวมเชื้อมาละลายและเจือจางดวยน้ำเกลือ 0.85% ใหไดความเขมขนของเชื้อ
ที่คณะผูวิจัยทดสอบแลววาทำใหปลากะพงขาว ตาย 50 เปอรเซ็นต (LD50) ซึ่งเทากับ 1.4x106 cfu/ml ฉีดเช้ือ
เขา ชอ งทอ งปลาตวั ละ 0.1 มิลลิลติ ร บนั ทกึ การตายและการติดเช้ือของปลาในระยะเวลา 14 วัน

57

3. การวเิ คราะหภ ูมคิ ุม กนั แบบไมจำเพาะ
3.1 ไลโซไซม (Lysozyme Activity)
วัดการทำงานของไลโซไซมตามวิธีของ Obach et al. (1993) ดังนี้ ใสซีรัมของปลาตัวอยาง

25 ไมโครลิตร ในถาดหลุมแบบ 96 หลุม จำนวน 3 หลุม เติม Micrococcus lysodeikticus (0.02% ใน
0.05 M PBS, pH 6.2) ปริมาตร 175 ไมโครลิตร วัดการทำงานของเอนไซมดวยเครื่อง Microplate reader
ทุกๆ 2 นาที เปนเวลา 20 นาที ที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร คำนวณคาการทำงานของไลโซไซมจากอัตรา
การเปลี่ยนแปลงคาการดูดกลืนแสง (Optical Density, OD) เปนหนวยยูนิตตอมิลลิลิตร โดยหนึ่งยูนิตเทากับ
ปริมาณเอนไซมท่ที ำใหคา OD ลดลง 0.001 ตอ นาที

3.2 การจบั กนิ ส่ิงแปลกปลอม (Phagocytosis)
ตรวจวัดการจับกินสิ่งแปลกปลอมตามวิธีการของ Phillips et al. (1979) ดังน้ี วางแผน

Circular Cover Slip บนสไลดและยดึ ดว ย Permount โดยหนึ่งแผนสไลดมี 2 Circular Cover Slip ทิ้งใหแหง
1 คืน แยกเม็ดเลือดขาวจากไตสวนหนาโดยใช Percoll Gradient แลวเตรียมเม็ดเลือดขาวจากไตสวนหนา
ใหไดความหนาแนน 2x106 เซลลตอมิลลิลิตร จำนวน 400 ไมโครลิตร ผสมกับ เม็ด Latex Bead (2x108 เซลล
ตอมิลลิลิตร) จำนวน 100 ไมโครลิตร ดูดของผสมที่ไดปริมาตร 200 ไมโครลิตร ปลอยลงบน Circular Cover
Slip บนสไลดที่เตรียมไวโดยทำ 2 ซ้ำ บมในกลองความชื้นที่อุณหภูมิ 25o C เปนเวลา 2 ชั่วโมง คอยๆ ดูดสาร
ละลายบน Circular Cover Slip ออก แลวเติมสารละลาย Glutaraldehyde (0.125% ใน L-15 ที่มี 1%
Penicillin/Streptomycin) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร เพื่อหยุดปฏิกิริยาเปนเวลา 5 นาที จากนั้นลางเซลล
ทีเ่ กาะอยบู น Circular Cover Slip ดว ย L-15 จำนวน 3 ครงั้ ยอมสสี ไลดดว ย Diff Quick ทิ้งใหแ หง นำไปตรวจ
ดวยกลองจุลทรรศน เพื่อนับจำนวนเซลลเม็ดเลือดขาวที่กิน Latex Bead จำนวน Latex Bead ที่ถูกเซลล
เม็ดเลือดขาวกิน และจำนวนเซลลเม็ดเลือดขาวทั้งหมด โดยนับจำนวนเซลลเม็ดเลือดขาว 300 เซลลตอ
1 Circular Cover Slip นำขอมลู มาคำนวณหาคา

Phagocytic Activity = (จำนวนเซลลเม็ดเลือดขาวทก่ี นิ Bead/จำนวนเซลลเม็ดเลอื ดขาวทั้งหมด) x 100
Phagocytic Index = จำนวน Bead ทงั้ หมดที่ถกู กนิ /จำนวนเซลลเ มด็ เลอื ดขาวทก่ี ิน Bead

4.การวิเคราะหขอ มลู
คำนวณหาคาเฉลี่ยของปริมาณไลโซไซม, Phagocytic Activity, Phagocytic Index และอัตรารอด

ของปลาแตละชุดการทดลอง แลววิเคราะหความแตกตางทางสถิติของขอมูลแตละพารามิเตอร โดยวิเคราะห
ความแปรปรวน (Analysis of Variance) และเปรียบเทียบความแตกตางของคาเฉลี่ยระหวางชุดการทดลอง
ดว ย LSD ทีร่ ะดับความเชือ่ มั่น 95% โดยใชโปรแกรม Microsoft Excel

58

ผลการศกึ ษา
1. การตอบสนองของภูมิคมุ กันแบบไมจำเพาะ

1.1 ไลโซไซม
ปลากะพงขาวที่ไดรับอาหารเม็ดที่เคลือบบัวบกแหงบดละเอียดซึ่งมีปริมาณบัวบก 3 ระดับ

คือ 0%, 2.5% และ 5.0% เปนเวลา 3 สัปดาห เมื่อตรวจวิเคราะหภูมิคุมกันของปลากะพงขาวหลังใหอาหาร
เปนเวลา 1, 2 และ 3 สัปดาห พบวาปริมาณไลโซไซมเฉลี่ยในปลาแตละชุดการทดลองอยูในชวง 5.19 – 6.76
ซึง่ ไมแ ตกตา งกนั ทางสถติ ิ ดงั แสดงในตารางท่ี 1

ตารางที่ 1 Lysozyme Activity ในปลากะพงขาวที่ไดรับอาหารเสริมบัวบกในระดับ 0, 2.5 และ 5.0%
เปน ระยะเวลา 3 สปั ดาห (Mean ± S.D.)
ระยะเวลา Lysozyme Activity
(สปั ดาห)
0% 2.50% 5.00%

1 6.31 ± 2.37a 5.49 ± 1.42 a 5.94 ± 1.78 a

2 5.19 ± 1.40 a 6.21 ± 1.80 a 6.59 ± 2.20 a

3 6.22 ± 1.94 a 5.62 ± 2.38 a 6.76 ± 2.05 a

หมายเหตุ คาเฉลี่ยในแถวเดียวกันที่มีตัวอักษรภาษาอังกฤษกำกับตางกัน มีความแตกตางกันอยางมีนัยสำคัญ
ทางสถติ ิ (P<0.05)

1.2 การจบั กนิ สง่ิ แปลกปลอม (Phagocytosis)
การจับกินสิ่งแปลกปลอมของเซลลเม็ดเลือดขาวในปลากะพงขาวที่ใหอาหารเคลือบบัวบก

3 ระดับ คือ 0%, 2.5% และ 5.0% ตางกันทางสถิติ โดย Phagocytic Activity ในปลาชุดทีไ่ ดรบั อาหารเสริม
บัวบกทั้ง 2 ชุด สูงกวาปลาชุดที่ไดรับอาหารที่ไมมีบัวบกอยางมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) หลังจากไดรับ
อาหารเปนระยะเวลา 2 และ 3 สัปดาห ในขณะที่ Phagocytic Index ในปลาที่ไดรับอาหารเสริมบัวบก
2.5 และ 5.0% มีคาสูงกวาปลาที่ไดรับอาหารชุดควบคุมท่ีไมมีบัวบก อยางมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05)
ทั้ง 3 สัปดาห โดยในสัปดาหที่ 1 และ 2 ปลาชุดที่ไดรับอาหารเสริมบัวบก 5.0% มีคา Phagocytic Index
สูงที่สุด ถัดมาคือปลาไดรับอาหารเสริมบัวบก 2.5 และ 0% ตามลำดับ ซึ่งแตกตางกันอยางมีนัยสำคัญทางสถิติ
(P<0.05) ดงั แสดงในตารางที่ 2

59

ตารางที่ 2 Phagocytic Activity และ Phagocytic Index ในปลากะพงขาวที่ไดรับอาหารเสริมบัวบกในระดับ
0, 2.5 และ 5.0% เปนระยะเวลา 3 สัปดาห (Mean ± S.D.)
ระยะเวลา Phagocytic Activity (%)
(สปั ดาห)
0% 2.50% 5.00%

1 18.50 ± 4.30a 19.58 ± 3.00a 20.75 ± 4.29a

2 19.83 ± 4.30a 23.08 ± 5.38ab 26.83 ± 8.18bc

3 17.92 ± 4.40a 26.25 ± 6.90b 30.17 ± 5.97b

ระยะเวลา Phagocytic Index (Beads/Cell)
(สปั ดาห)
0% 2.50% 5.00%

1 3.26 ± 0.85a 4.15 ± 1.14b 5.09 ± 1.26c

2 3.15 ± 0.86a 6.74 ± 2.41b 8.18 ± 2.31c

3 3.34 ± 1.18a 11.42 ± 3.83b 14.46 ± 5.58b

หมายเหตุ คาเฉลี่ยในแถวเดียวกันที่มีตัวอักษรภาษาอังกฤษกำกับตางกัน มีความแตกตางกันอยางมีนัยสำคัญ
ทางสถิติ (P<0.05)

2. ความตานทานเชื้อ Streptococcus
อัตรารอดของปลากะพงขาวที่ไดรับอาหารเสริมบัวบกในระดับ 0, 2.5 และ 5.0% เปนระยะเวลา

3 สัปดาห หลังฉีดเชื้อ Streptococcus agalactiae เปนวลา 14 วัน พบวา ปลาชุดที่ไดรับอาหารเสริมบัวบก
ในระดับ 5.0% มีอัตรารอดสูงที่สุด ถัดมาคือชุดท่ีที่ไดรับอาหารเสริมบัวบกในระดับ 2.5 และ 0% ตามลำดับ
แตไมมีความแตกตางกันทางสถิติ (P>0.05) โดยหลังใหอาหารเปนระยะเวลา 3 สัปดาห ปลามีอัตรารอดเฉลี่ย
38.89±19.62, 61.11±9.62 และ 66.67±16.67% ในปลาชุดที่ไดรับอาหารเสริมบัวบก 0, 2.5 และ 5.0%
ตามลำดบั ดังแสดงในตารางที่ 3

ตารางท่ี 3 อัตรารอดหลงั ฉดี เชื้อ Streptococcus agalactiae เปนวลา 14 วัน ในปลากะพงขาวทีไ่ ดรับอาหาร
เสรมิ บวั บกในระดับ 0, 2.5 และ 5.0% เปน ระยะเวลา 3 สัปดาห (Mean ± S.D.)
ระยะเวลา อัตรารอด (%)
(สัปดาห)
0% 2.50% 5%

1 38.89 ± 19.25a 44.44 ± 9.62a 55.56 ± 9.62a

60

2 44.44 ± 9.62a 50.00 ± 16.67a 55.56 ± 9.62a

3 38.89 ± 19.62a 61.11 ± 9.62a 66.67 ± 16.67a

หมายเหตุ คาเฉลีย่ ในแถวเดียวกนั ทีม่ ีตวั อักษรภาษาองั กฤษกำกับเหมือนกนั ไมม ีความแตกตางอยา งมีนัยสำคัญ
ทางสถิติ (P>0.05)

สรุปและวิจารณผล

ผลการทดลองเสริมบัวบก (Centella asiatica) ในอาหารที่ใหปลากะพงขาว พบวาสามารถกระตุน
ภูมิคุมกันแบบไมจำเพาะในการจับกินสิ่งแปลกปลอมของเซลลเม็ดเลือดขาว ทั้งคา Phagocytic Activity และ
Phagocytic Index ใขณะที่ Srichaiyo et al. (2020) ศกึ ษาการใหอาหารผสมบัวบกผงท่ีระดับ 0, 5, 10 และ
20 กรัมตอกิโลกรัม แกปลานิลเปนระยะเวลา 61 วัน พบวาปลานิลที่ไดรับอาหารชุดที่ผสมบัวบก 5 และ
10 กรัมตอกิโลกรัม มี Phagocytic Index สูงกวาปลาที่ไดรับอาหารชุดควบคุม นอกจากนั้น ปลานิลที่ไดรับ
อาหารผสมบัวบกผง 10 และ 20 กรัมตอกิโลกรัม พบวามีปริมาณไลโซไซมในซีรัมสูงกวาปลาที่ไดรับอาหาร
ชุดควบคุมทไ่ี มเ สริมบวั บก ตางจากการศึกษาคร้งั น้ที ่ีพบวา ปริมาณไลโซไซมใ นปลากะพงขาวท่ีไดร บั อาหารทุกชุด
ไมแ ตกตางกนั ทางสถติ ิ ซง่ึ อาจเปน เพราะการใหอาหารเสริมบัวบกในการศึกษาครั้งนค้ี อนขางสนั้ เพยี ง 3 สัปดาห

ในการศกึ ษาความตานทานของเชื้อ Streptococcus ในการศกึ ษาครงั้ น้ี ปลากะพงขาวท่ไี ดร บั อาหาร
ทีเ่ สรมิ บัวบก 2.5 และ 5.0% เปน ระยะเวลา 2 และ 3 สัปดาห หลงั จากไดรับเชอ้ื S. agalactiae แลว เปนเวลา
14 วนั พบวา มีอตั รารอดสูงกวาปลาชุดควบคุมแตไมมีความแตกตา งทางสถิติ ซ่งึ รายงานของ ชยั เดช และคณะ
(2547) ท่ศี ึกษาฤทธติ์ า นเช้ือแบคทีเรยี แกรมบวกของสารสกัดบวั บกในหองปฏบิ ัติการ พบวาสารสกัดบัวบกมีฤทธิ์
ตานเชื้อ Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae และ S. uberis โดยมีคาต่ำสุดที่สามารถยับย้ัง
การเจริญเติบโตของเชื้อ (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 0.4 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร นอกจากนั้น
จากรายงานของ Purkait et al. (2018) ยังพบวาสารสกัดบัวบกดวยคลอโรฟอรมในหลอดทดสอบ พบวา
สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Edwardsiella tarda ซึ่งเปนแบคทีเรียที่กอโรคในปลาเชนเดียวกับ
เชื้อ S. agalactiae ที่ใชในการศึกษาในครั้งนี้ ดังนั้นอาจเปนไปไดวาปลาที่ไดรับอาหารเสริมบัวบกมีความ
ตา นทานเชอื้ S. agalactiae สงู กวา ปลาชดุ ควบคุมทีไ่ มไ ดเ สริมบัวบกในอาหาร แตท ้ังนอ้ี าจเน่ืองจากจำนวนปลา
ท่ีฉีดเชอ้ื ในแตล ะซำ้ ของชดุ การทดลองครงั้ นค้ี อนขางนอยจงึ ทำใหไมพ บความแตกตางชัดเจนในทางสถติ ิ ซ่งึ ควรมี
การศกึ ษาเพิม่ เตมิ เกีย่ วกับการตานทานเชื้อดังกลาว เพอ่ื ใหไ ดผลการศึกษาที่ชัดเจนข้ึน

การศึกษาแสดงใหเห็นวาบัวบกเปนสมุนไพรท่ีสามารถกระตุนภูมิคุมกันในปลากะพงขาว โดยการให
อาหารทเ่ี สรมิ บวั บกทีร่ ะดับ 2.5 และ 5.0% เปน ระยะเวลา 2 และ 3 สปั ดาห

61

เอกสารอา งอิง
จิราพร เกษรจันทร, มณฑริ า ถาวรยตุ ิการต และ ธรี าวัฒน จรติ งาม. 2551. แบคทเี รีย Streptococcus iniae มี

สวนในการตายของปลาชอนทะเล (Rachycentron canadum, Linnaeus) ที่เลี้ยงในฟารม. วารสาร
การประมง 61(6): 540-543.
ชัยเดช อินทรชัยศรี, กิติศักดิ์ อัจฉริยะขจร และ กุสุมา สามงามนิ่ม. 2547. ฤทธิ์ตานแบคทีเรียของสารสกัด
สมุนไพรบางชนิดตอแบคทีเรยี ทเ่ี ปน สาเหตุเตานมอักเสบในโคนม. ประมวลบทคดั ยอการประชุมวิชา การ
ทางสัตวแพทยแ ละการเลย้ี งสัตว คร้งั ท่ี 30. หนา 151.
เฉลิม หวันหมาน, ธนาวุฒิ กลาวเกลยี้ ง และ กจิ การ ศุภมาตย. 2548. โรคสเตรปโตคอคอโคซสี ในปลากะพงขาว.
ว. สงขลานครนิ ทร 27 (ฉบับพิเศษ 1): 291-305.
นเรศ ซวนยุก, หิรัญ กังแฮ, เรวัตร คงประดิษฐ และ กิจการ ศุภมาตย. 2548. โรคติดเชื้อ Streptococcus
agalactiae ในปลานิล (Oreochromis nilotica). ว. สงขลานครินทร วทท. ปที่ 27 (ฉบับพิเศษ 1): 307-320.
เยาวนิตย ดนยดล, สถาพร ดเิ รกบุษราคม และ เพญ็ ศรี เมืองเยาว. 2543. คณุ สมบัติของเชือ้ และการเกิดโรคจาก
เชื้อ β–hemolytic Streptococcus sp. ในปลากะพงขาวที่เลี้ยงในจังหวัดปตตานีและจังหวัดสงขลา.
เอกสารวิชาการฉบบั ท่ี 8/2543 สถาบนั วิจัยการเพาะเลยี้ งสัตวน้ำชายฝง , กรมประมง. 11 หนา .
วีณา เคยพุดซา, อรัญญา พลพรพิสิฐ และ ณิฏฐารัตน ปภาวสิทธิ์. 2550. ประสิทธิภาพของน้ำแชใบหูกวางตอ
การรกั ษาโรคตดิ เชื้อแบคทีเรยี ในปลากัดและปลาหางนกยูง. วารสารการประมง 60 (6): 528-533.
สถาพร ดิเรกบษุ ราคม และ เยาวนิตย ดนยดล. 2530. โรคระบาดทีเ่ กิดจาก non-haemolytic Streptococcus
sp. ในปลากะพงขาว. เอกสารวิชาการฉบับที่ 6/2530. สถาบันวิจัยการเพาะเลี้ยง สัตวน้ำชายฝง, กรม
ประมง. 12 หนา.
สำนักงานขอมูลสมุนไพร. 2551. ขอมูลทางพฤกษศาสตร. (ออนไลน). แหลงที่มา: http://www.
medplant.mahidol.ac.th/index.asp สืบคน เมื่อ 15 มีนาคม 2552.
Obach, A., Quentel, C. and Laurencin, F.B. 1993. Effect of alpha-tocopherol and dietary oxidized
fish oil on the immune response of seabass, Dicentrarchus labrax. Dis. Aquat. Org. 15: 175-185.
Phillips, W.A., Shelton M.J. and Hosing, C.S. 1979. A simple micro-assay for neutrophil bactericidal
activity. J. Immunol. Meth. 26: 187-192.
Srichaiyo, N., Tongsiri, S., Hoseinifar, S.H., Dawood, M.A.O., Jaturasitha, S., Esteban, M.A., Ringo,
E., van Doan, H. 2020. The effects gotu kola (Centella asiatica) powder on growth
performance, skin mucus, and serum immunity of Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
fingerlings. Aquac. Rep. 16: 100239. Doi: 10.1016/j.aqrep.2019.100239
Purkait, S., Abraham, T.J., Karmakar, S., Dey, B. and Roy, A. 2018. Inhibition of Fish Pathogenic
Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda by Centella asiatica In-vitro. J. Aquac. Res.
Dev. 9: 524. Doi: 10.4172/2155-9546.1000524

62

การตรวจหาซิงเกิลนวิ คลีโอไทดโพลมี อรฟ ซ มึ ของยนี ในระบบภูมิคมุ กัน
ท่มี คี วามสมั พนั ธก บั ความตา นทานโรคไวรัสตวั แดงดวงขาว

ในกงุ ขาวแวนนาไม (Litopenaeus vannamei Boone, 1931)

Identification of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of Immune-related Genes to
White Spot Syndrome Virus Resistance in

Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei Boone, 1931)
นางจุไลวรรณ รงุ กำเนดิ วงศ1 นายวศิ รตุ ชัยเลศิ ฤทธ2ิ์ นางอำไพ ลองลอย3 และนางจริ าวรรณ วงั บุตร4

1ศูนยวิจัยสขุ ภาพสตั วน ้ำชายฝง 130/2 ม. 8 ต. พะวง อ. เมือง จ. สงขลา 90100
2ศนู ยว จิ ยั และพฒั นาพนั ธกุ รรมสตั วนำ้ ปทุมธานี 39 ม.1 ต. คลองหา อ. คลองหลวง จ. ปทุมธานี 12120

3ศนู ยวิจัยและพฒั นาการเพาะเล้ียงสตั วนำ้ ชายฝง กระบ่ี 141 ม.6 ต. ไสไทย อ. เมือง จ.กระบ่ี 81000
4ดานตรวจประมงระนอง 174 ม.1 ต.ปากนำ้ อ.เมอื ง จ.ระนอง 85000

วตั ถุประสงค
1. เพอ่ื ศกึ ษาและพฒั นาเคร่ืองหมายดเี อน็ เอซงิ เกิลนวิ คลโี อไทดโพลมี อรฟซ ึมของยนี ทเ่ี กย่ี วของกับระบบ

ภมู ิคมุ กนั ในกงุ ขาวแวนนาไม
2. เพอื่ ศึกษาความสมั พนั ธข องเคร่อื งหมายดีเอ็นเอ ซิงเกลิ นิวคลโี อไทดโ พลมี อรฟซ มึ ของยีนทีเ่ กยี่ วของกบั

ระบบภูมคิ มุ กนั กบั ความตานทานโรคไวรสั ตัวแดงดวงขาวในกงุ ขาวแวนนาไม
วธิ ีดำเนนิ การ

1. การเตรียมสตั วท ดลอง
นำกุงขาวแวนนาไมน้ำหนักประมาณ 3-5 กรัม จากสถาบันวิจัยการเพาะเลี้ยงสัตวน้ำชายฝง

จำนวน 30 ครอบครัว ๆ ละ 100 ตัว ที่ผานการสุมตรวจโรคตัวแดงดวงขาว โรคหัวเหลือง โรคทอรา โรคไอเอช
เอชเอ็นวี ดว ยเทคนคิ พซี อี าร มาเล้ียงดว ยอาหารกงุ ขาวแวนนาไมสำเร็จรปู ในถงั พลาสติกขนาด 2 ตัน ปรบั สภาพ
กงุ เปนเวลา 1 อาทิตย ใหอ าหารกงุ วันละ 3 มื้อ ประมาณ 5 เปอรเซน็ ตของน้ำหนักตัวกุง ดดู ตะกอนและเปลี่ยน
ถา ยน้ำ 50 เปอรเ ซน็ ตท กุ วนั

2. การเตรียมเช้ือไวรัสตวั แดงดวงขาว
นำเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวซึ่งเก็บที่อุณหภูมิ -80 องศาเซลเซียส มาเพิ่มความรุนแรงของเช้ือ

โดยนำไปฉีดกลับเขากุงขาวแวนนาไม ขนาดน้ำหนักประมาณ 4-6 กรัม จำนวน 100 ตัว และเก็บเชื้อจากกุงท่ีมี
อาการปวย แลวนำไปทดสอบการติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวดวยเทคนิคพีซีอาร (OIE, 2012) นำตัวอยางกุงท่ี
ตรวจพบเช้อื ไวรัสตวั แดงดวงขาวไปตัดเหงือกกุงมาบดดวยน้ำเกลือปลอดเชื้อ 2.6 เปอรเ ซ็นต ในอัตราสวน 1:10
นำไปเหว่ียงตกตะกอนเนือ้ เยื่อท่ี 3,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที ทอี่ ุณหภมู ิ 4 องศาเซลเซียส นำสว นใส
มากรองผานหัวกรอง (Syringe filter) ขนาด 0.45 ไมครอน เก็บสวนใสใสหลอด และสุมเชอื้ จำนวน 5 หลอด
เพื่อนำไปหาความเขมขนเริ่มตนของเชื้อไวรัสดวยเทคนิค Real Time PCR เก็บหลอดเชื้อไวรัสทั้งหมดไวที่
อุณหภูมิ -80 องศาเซลเซยี ส (Stock virus) ตามวธิ ีของ จริ าพร และคณะ (2538)

63

3. การทดสอบความรนุ แรงของเช้อื ไวรสั ตัวแดงดวงขาว
นำเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว (Stock virus) มาเจือจางดวยน้ำเกลือปลอดเชื้อความเขมขน

2.6 เปอรเ ซน็ ตใ หไ ดความเขม ขน ของเชือ้ 10-1 - 10-10 CFU/ml โดยเจอื จางปรมิ าณเช้อื คร้งั ละ 10 เทา (10 fold
dilution) นำเชื้อที่ระดับความเขมขน 10-7 – 10-10 CFU/ml ฉีดกุงขาวแวนนาไมน้ำหนักประมาณ 3.32+0.52
กรัม เขาตัวกุงบริเวณกลามเนื้อทองปลองสุดทายตัวละ 100 ไมโครลิตร รวมทั้งกลุมควบคุมฉีดดวยน้ำเกลือ
ปลอดเชื้อความเขมขน 2.6 เปอรเซ็นต ความเขมขนละ 3 ซ้ำ ๆ ละ 10 ตัว ในตูกระจกขนาด 30 ลิตร บันทึก
อัตราการตายของกุงเปนเวลา 14 วัน เพื่อนำไปหาระดับเชื้อที่ทำใหกุงตาย 50 เปอรเซ็นต (ID50) ที่ระยะเวลา
14 วนั ตามวธิ ขี อง Reed และ Muench (1983)

4. การฉีดเชื้อเช้ือไวรสั ตวั แดงดวงขาวในกุงทดลอง
นำกุงขาวแวนนาไมทม่ี ีน้ำหนักประมาณ 3-5 กรมั จำนวน 10 ครอบครวั มาฉีดเชื้อไวรัสตัวแดง

ดวงขาวในระดับการเจือจางที่ทำใหกุงติดเชื้อและตาย 50 เปอรเซ็นต (Infective dose, ID50) ตัวละ 100
ไมโครลิตร บริเวณกลามเนื้อทองปลอ งสุดทา ย ครอบครัวละ 100 ตัว ใสในถงั พลาสติกขนาด 1 ตนั ตอครอบครัว
จำนวน 10 ถัง และกลุมควบคุมฉีดดวยนำ้ เกลอื ปลอดเช้ือความเขมขน 2.6 เปอรเ ซน็ ต รวม 10 ครอบครัว ๆ ละ
10 ตัว ใสในถังพลาสติกขนาด 1 ตันตอซ้ำ จำนวน 3 ถัง สังเกตอาการของกุงทดลองเปนเวลา 14 วัน
โดยกงุ ทกุ ตัวท่ตี ายจากการทดลองตัง้ แตว นั ที่ 2 หลงั ฉดี เชื้อไวรัส จะถกู เกบ็ รกั ษาไวทอ่ี ุณหภมู ิ -80 องศาเซลเซียส
เพื่อใชสำหรับสกัดดีเอ็นเอ สวนกุงทุกตัวที่รอดตายหลังสิ้นสุดการทดลองจะตัดขาวายน้ำ และสกัดดีเอ็นเอ
ดีเอ็นเอที่สกัดไดจ ะเก็บไวทีอ่ ุณหภูมิ -80 องศาเซลเซียส เพ่อื รอทดสอบตอไป

5. การออกแบบไพรเมอร และการเพิ่มปริมาณดเี อ็นเอดวยเทคนคิ พซี ีอาร
ออกแบบไพรเมอรจากลำดับนิวคลีโอไทดของยีนที่เกี่ยวของกับระบบภูมิคุมกัน (ตาราง ที่ 1)

โดยใหความยาวของไพรเมอรอยูที่ 19-23 นิวคลีโอไทด คา Melting temperature (Tm) ของทั้งสองสาย
ใกลเคียงกัน คา GT content อยูที่ประมาณ 40-60 เปอรเซ็นต ความยาวของ PCR product อยูที่ประมาณ
600 – 900 คเู บส และออกแบบใหค รอบคลุมท้ังยีน

หลังการทดสอบความตา นทานโรคจากเชอ้ื ไวรสั ตัวแดงดวงขาว นำกุงขาวทีร่ อดชีวติ จาก
ครอบครวั ท้ัง 10 ครอบครวั มาแบงเปน 2 กลมุ ดังน้ี

กลุมที่ 1 ครอบครัวที่มีอัตราการรอดตายต่ำสุด ใกลเคียง 50 เปอรเซ็นต โดยแบง ตัวอยาง
ในแตล ะครอบครวั ออกเปน ตัวอยางกุงตายภายใน 4-8 วัน และ ตวั อยางกุงรอดตาย

กลุมที่ 2 ครอบครัวที่มีอัตราการรอดตายมากกวา 50 เปอรเซ็นต โดยแบงตัวอยางใน แตละ
ครอบครัวออกเปน ตัวอยางกงุ ตายภายใน 4-8 วนั และ ตวั อยา งกงุ รอดตาย

นำตัวอยางกุงในกลุมที่ 1 และ กลุมที่ 2 มาสกัดดีเอ็นเอ เพื่อใชเปนดีเอ็นเอตนแบบในการ
ตรวจหาอุณหภูมิที่เหมาะสมกับไพรเมอร ซึ่งจำเพาะกับยีนในระบบภูมิคุมกันที่ไดจากการสังเคราะหทั้งหมด
15 คไู พรเมอร (ตารางที่ 1) ซ่ึงองคประกอบในการทำปฎกิ ิรยิ าพีซีอาร (ตารางที่ 2)

64

ตารางที่ 1 ยนี ในระบบภูมคิ ุมกันกุงขาว ทใี่ ชในการตรวจหาสนปิ ส
No. gene GenBank # Size (bp) Reference
Sellos et al., 1997
1 Hemocyanin X82502 2,597 Sun et al., 2007
Gao et al., 2007
2 β-actin AF300705 1,320 Ma et al., 2007
Wang et al., 2007
3 Lysozyme AY170126 951

4 Lectin DQ871245 1,316

5 Prophenoloxidase AY723296 2,061

ตารางที่ 2 สารละลายสำหรับการเพิ่มปริมาณดเี อ็นเอดว ยเทคนิคพีซีอารตอ 1 ปฏิกริ ยิ า
สารละลาย ความเขมขนสุดทาย ปรมิ าตร (ไมโครกรัม)

DNA template (ng/ul) 10 นาโนกรัม 1

Taq DNA polymerase (10x) 1x 5

Forward primer 0.25 ไมโครโมลาร 0.25

Reward primer 0.25 ไมโครโมลาร 0.25

dH2O 3.5

Total volume 10

เตรียมสารละลายสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอดวยเทคนิคพีซีอารตามตารางที่ 2 โปรแกรม
สำหรับควบคุมอุณหภูมิสำหรับทำปฎิกิริยาในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ ดังนี้ ใชอุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส
ระยะเวลา 3 นาที, เพิ่มปริมาณ DNA จำนวน 35 รอบ (Denaturation ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส เปนเวลา
30 วินาท,ี Annealing ตามไพรเมอร ใชเ วลา 30 วนิ าที และ Extension ทีอ่ ุณหภมู ิ 72 องศาเซลเซียส เปนเวลา
1 นาที) โดยโปรแกรมควบคุมอุณหภูมิ สำหรับทำปฎิกิริยาในแตละไพรเมอรชวง Annealing เปลี่ยนแปลงไป
ตามอุณหภูมิที่เหมาะสมของไพรเมอร จากนั้นเพิ่มปริมาณดีเอนเอของกลุมตัวอยางในแตละครอบครัวดวย
ไพรเมอรท อ่ี อกแบบได

65

ความกาวหนา ผลการทดลอง
1. ความรนุ แรงของเช้ือไวรัสตัวแดงดวงขาว

ภายหลังจากฉีดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวที่ระดับความเขมขนของเชื้อ 10-1 - 10-10 CFU/ml
พบวากุงมีอัตราการตาย 100 เปอรเซ็นต ที่ระดับความเขมขนของเชื้อ 10-1 - 10-6 CFU/ml สวนที่ระดับความ
เขมขนของเชื้อ 10-7 - 10-10 CFU/ml กุงมีอัตรารอด 50-100 เปอรเซ็นต หลังจากน้ัน จึงฉีดเชื้อไวรัสตัวแดง
ดวงขาวที่ระดับความเขมขนของเชื้อ 10-7 - 10-10 CFU/ml ซึ่งใหผลการทดลอง ดังตารางที่ 3 เมื่อนำผลการ
ทดลองไปคำนวณหาระดับเชื้อที่ทำใหกุงตาย 50 เปอรเซ็นต (ID50) ที่ระยะเวลา 14 วัน ตามวิธีของ Reed และ
Muench (1983) พบวามีคา (ID50) ท่ีระยะเวลา 14 วัน เทา กบั 10-8.85 CFU/ml

ตารางท่ี 3 อัตราการตายของกุงท่ีไดรับเชือ้ ไวรสั ตัวแดงดวงขาวทร่ี ะดับความเขมขนตา งๆ เปน ระยะเวลา 14 วนั
ซำ้ /อัตราการตาย (%)
ระดับความ อตั ราการตาย
เขม ขน 1 2 3 4 5 (%)

ชุดควบคุม 10 0 0 10 10 6

10 -7 100 100 100 100 100 100

10 -8 100 10 100 100 0 62

10 -9 20 0 100 100 20 48

10 -10 0 10 20 10 0 8

2. การทดสอบความตานทานโรคจากเช้อื ไวรสั ตัวแดงดวงขาว
ภายหลังจากฉีดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวที่ระดับเชื้อที่ทำใหกุงตาย 50% (ID50) =10-8.85

CFU/ml ในกุงขาวแวนนาไมทั้ง 10 ครอบครัว และบันทึกจำนวนการตายของกุงเปนเวลา 14 วัน พบวากุงขาว
แวนนาไมมีอัตราการตายมากทส่ี ดุ 84 เปอรเ ซน็ ตในครอบครวั Q4 และมอี ัตราการตายนอยที่สุด 43 เปอรเซ็นต
ในครอบครวั Q3 ตารางท่ี 4

66

ตารางที่ 4 อตั ราการตายของกุงท่ีไดร บั เชอ้ื ไวรัสตัวแดงดวงขาวท่รี ะดับ ID50 เปนระยะเวลา 14 วัน

ครอบครัว จำนวนกุง จำนวนกุง ตายหลังไดรับเช้ือไวรสั ตัวแดงดวงขาวเปน เวลา 14 วัน อัตรา
เร่ิมตน การตาย
(ตวั ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (%)

Q1 100 5 1 13 14 13 18 6 70

Q2 100 6 4 15 2 13 3 3 2 0 1 49

Q3 100 2 6 5 5 4 6 6 6 2 1 43

Q4 100 3 4 6 12 11 4 9 8 10 14 3 84

Q5 100 3 4 12 27 12 13 6 77

Q6 100 7 4 14 13 1 7 4 7 57

Q7 100 8 2 3 7 13 8 7 7 6 3 6 1 71

Q8 100 12 7 3 4 5 4 4 5 2 1 1 3 2 53

Q9 100 5 15 13 17 16 5 71

Q10 100 8 11 12 13 10 9 2 65

จํานวนกุงตาย ( ัตว)จากอัตราการตายของกุงทั้ง 10 ครอบครัวหลังไดรบั เชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวทีร่ ะดับ ID50 เปน
ระยะเวลา 14 วัน สามารถแบงกลุมตัวอยางออกเปน 4 กลุม ดังนี้ กลุมที่ 1 กุงตายภายใน 1-3 วันกลุมที่ 2 กุง
ตายระหวางวันที่ 4-8 กลุมที่ 3 กุงตายระหวางวันที่ 9-14 และกลุมที่ 4 กุงรอดจากการติดเชื้อ (ภาพที่ 1) สวน
กุงขาวแวนนาไมในกลุมควบคุมที่ฉีดดวยน้ำเกลือปลอดเชื้อความเขมขน 2.6 เปอรเซ็นต มีอัตรารอดตาย
98 เปอรเ ซ็นต

Q1
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9
Q10

การตายของกุงขาวแวนนาไมหลังไดร ับเช้อื ไวรัสตัวแดงดวงขาวเปนเวลา 14

67

ภาพที่ 1 การตายของกุงขาวแวนนาไมท้ัง 10 ครอบครัว ชว งเวลาตางกนั หลังไดร บั เช้ือไวรัสตัวแดงดวงขาว และ
จำนวนกุงรอดตาย

3. การทดสอบไพรเมอร ดว ยเทคนิคพีซีอาร
จากการออกแบบไพรเมอรจากยีนที่เกี่ยวของกับระบบภูมิคุมกันจำนวน 5 ยีน ไดแก

Hemocyanin, β-actin, Lysozyme, Lectin และ Prophenoloxidase โดยใชลำดับนิวคลีโอไทดจาก
ฐานขอมูล Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)(ตารางที่ 1) สามารถออกแบบไพรเมอรไดจำนวน 30
ต ำ แ ห น  ง โ ด ย แ บ  ง เ ป  น ไ พ ร เ ม อ ร  ส ำ ห ร ั บ ย ี น Hemocyanin, β-actin, Lysozyme, Lectin แ ล ะ
Prophenoloxidase จำนวน 7, 4, 5, 5 และ 9 ตำแหนง ตามลำดับ (ตารางที่ 5) เมื่อนำไพรเมอร ที่ออกแบบ
ไดมาทดสอบพบวาในยีน Hemocyanin สามารถสรางผลผลิต PCR ไดจำนวน 5 ตำแหนง และไมสามารถสราง
ผลผลิต PCR ไดจำนวน 2 ตำแหนง ยีน β-actin ไมสามารถสรา งผลผลติ PCR ไดท ัง้ 4 ตำแหนง ยนี Lysozyme
สามารถสรางผลผลิต PCR ไดทั้ง 5 ตำแหนง ยีน Lectin สามารถสรางผลผลิต PCR ไดทั้ง 3 ตำแหนง โดยใน
จำนวนนี้มี 2 ตำแหนงที่มีขนาดของผลผลิต PCR ไมตรงกับ ที่ออกแบบได และไมสามารถสรางผลผลิต PCR
ไดจำนวน 2 ตำแหนง ยีน Prophenoloxidase สามารถสรางผลผลิต PCR ไดท้ัง 7 ตำแหนง โดยในจำนวนนี้มี
5 ตำแหนงที่มีขนาดของผลผลิต PCR ไมตรงกับ ที่ออกแบบได และไมสามารถสรางผลผลิต PCR ไดจำนวน
2 ตำแหนง (ตารางท่ี 5)

เมื่อพิจารณาไพรเมอรที่ออกแบบไดจำนวน 30 ตำแหนง พบวาสามารถสรางผลผลิต PCR ได
จำนวน 20 ตำแหนง โดยในจำนวนนี้มี 7 ตำแหนงที่มีขนาดของผลผลิต PCR ไมตรงกับที่ออกแบบได ทั้งน้ี
เนื่องจากไดออกแบบไพรเมอรจาก mRNA (ยกเวนยีน Lysozyme ที่ออกแบบมาจาก DNA) และนำไปสราง
ผลผลิต PCR โดยใช DNA เปน ตนแบบ ซ่ึงจะมีลำดับนิวคลโี อไทดข อง Intron เพ่ิมเขา มา ทำใหข นาดของผลผลิต
PCR ไมตรงกับที่ออกแบบได นอกจากนี้ยังมีไพรเมอรจำนวน 10 ตำแหนงที่ไมสามารถสรางผลผลิต PCR ได
ทั้งนี้อาจเปนผลมาจากบริเวณของลำดับนิวคลีโอไทดที่ไพรเมอรเขาจับเปนบริเวณที่เกิดกระบวนการ Splicing
หรอื กระบวนการการตดั Intron ของ RNA นอกจากนี้อาจเกิดจากการมลี ำดับนวิ คลโี อไทดข อง Intron ท่เี พ่ิมเขา
มามีความยาวมาก สงผลใหการสรา งผลผลิต PCR ไมสมบรู ณไ ด

สำหรับโครงการวิจัยนี้เปนโครงการวิจัยตอเนื่องที่มีระยะเวลาในการดำเนินงานวิจัย 2 ป
แตเนื่องจากในปที่ 2 โครงการวิจัยนี้ไมไดรับการสนับสนุนดานงบประมาณ ทำใหไมสามารถดำเนินงานวิจัย
ในสวนของการศึกษาหา SNPs ในยีนที่เกี่ยวของกับระบบภูมิคุมกันที่มีความสัมพันธตอความตานทานโรค
จากเช้อื ไวรัสตวั แดงดวงขาวได

ตารางที่ 5 ไพรเมอรที่ออกแบบไดจำนวน 30 ตำแหนง จาก 5 ยีนที่เกี่ยวของกับระบบภูมิคุมกันและผล การ
สรา งผลผลติ PCR
Gene Primer Primer sequence (5’-3) PCR product Result
Name size

Hemocyanin Liv/He1.1F AATAATGTTGCGCAGGAAGC 568 N

β-actin Liv/He1.1R CAGGTCTCCGTCCTGAATGT 397 68
Lysozyme Liv/He2.1F TGCTTTACATGCTTATCCTTCC 541
Liv/He2.1R TGTTCAGCCAAAGACGAGTG 569 N
Liv/He3.1F TCATCCACTGCAAAGACTGG 532 Y
Liv/He3.1R GCAGGGAACTGACCTCCATA 552 Y
Liv/He4.1F CACCAACTTACCGTCCGATT 476 Y
Liv/He4.1R GTGACAGACACGCCAGAGAA 418 Y
Liv/He5.1F GGGGATCCTCATGGAAAGTT 411 Y
Liv/He5.1R TCAGATCATGAGATAAACGGTAAAA 413 N
Liv/He6.1F GCCTGGCCTCATAAAGACAA 321 N
Liv/He6.1R TCGAATTCCAGGCCTCTATC 162 N
Liv/He7.1F GCAGTTGAAGGGTGGAAAAA 235 N
Liv/He7.1R AAAGAAACAATTCATTCATCGACA Y
Liv/Ba1.1F CGAGAGGAAGCAGCACGTA Y
Liv/Ba1.1R GTCATCTTCTCGCGGTTAGC
Liv/Ba2.1F ACTGGGACGACATGGAGAAG
Liv/Ba2.1R TCTCCTTGATGTCACGAACG
Liv/Ba3.1F CGCGACCTCACAGACTACCT
Liv/Ba3.1R AGGGCAGTGATTTCCTTCTG
Liv/Ba4.1F AAGGACCTGTACGCCAACAC
Liv/Ba4.1R TCCTTATCCTAATGGAATAATTAAATG
Liv/Lz1.1F CAGACACAGCCAAGCAACTT
Liv/Lz1.1R TTGCAACAACGCTACAAAGG
Liv/Lz2.1F GTCGTGGGCTGCACTTATTT

69

Liv/Lz2.1R GAAAGATGCGGGTTGAAAAA 289 Y
Liv/Lz3.1F CTCTAACGGCACCGATTCTG 479 Y
Liv/Lz3.1R TTCGGCAGCTTAGCTTTCTT 994 Y
Liv/Lz4.1F CGGTTGCGGAATTAGAAGA
Liv/Lz4.1R GACGCAACCATCACTGGATA
Liv/Lz5.1F ACGCACATAAACCAGGAGGA
Liv/Lz5.1R TCGTTGCAGTCCCAGTCAC

ตารางที่ 5 ไพรเมอรท ี่ออกแบบไดจ ำนวน 30 ตำแหนง จาก 5 ยีนทเ่ี กยี่ วของกับระบบภูมคิ มุ กันและผล การ
สรางผลผลติ PCR (ตอ)
Gene Primer Primer sequence (5’-3) PCR Result
Name product
size

Lectin Liv/Lt1.1F TGCTACACTACACTGCTAGATATTCA 299 N

Liv/Lt1.1R TTGGCAGCATGGCAGAAC

Liv/Lt2.1F CTTTGTTGCCGAACCCTATG 297 Y*

Liv/Lt2.1R CACGATGATGAAAGGCACAA

Liv/Lt3.1F CTTGGGAACTCCCTTCTGG 299 Y

Liv/Lt3.1R CGTCCTCCCAGGTCTCCT

Liv/Lt4.1F GGAGGTCTTTGCCTGATGTT 269 N

Liv/Lt4.1R GCACTGCCAGCATAAAGACC

Liv/Lt5.1F TTTATCAAGCCACGCCTTCT 272 Y*

Liv/Lt5.1R CTATGTTTCCCACGCCATTT

Prophenoloxidase Liv/Pp1.1F GTCCGTGGACCAGAGAACC 269 Y*

Liv/Pp1.1R ACGCGAGGAAGAAGGAGAAG

70

Liv/Pp2.1F GCCACGAGAGTAGGACTTTCC 399 N
N
Liv/Pp2.1R GGCTTCGCTCTGGTTAGGAT Y
Y
Liv/Pp3.1F GAACTCCATTCCGTCCGTCT 375 Y*
Y*
Liv/Pp3.1R CCAGTTGTCGAGCTTCTGAAC Y*
Y*
Liv/Pp4.1F CATGCACCAGCAAATTATCG 398

Liv/Pp4.1R CGCCGTAGTAAGGGAAGTTG

Liv/Pp5.1F GCAACGGTGACAAAGTTCCT 397

Liv/Pp5.1R CTTGTGTTCCAGCCTGTGAG

Liv/Pp6.1F CCACCGTACAAGGAAGAGGA 387

Liv/Pp6.1R GGACTCCTTGGATGACCTGA

Liv/Pp7.1F GATCCTCTGGTGTGAATTGGA 480

Liv/Pp7.1R CCCAGGAACTTGATGGTGAC

Liv/Pp8.1F CTTCATGCTCACCGACTACG 289

Liv/Pp8.1R AGCTATGAACCACAGCGTCA

Liv/Pp9.1F ACGTGACGCTGTGGTTCATA 226

Liv/Pp9.1R CTCGGTCCGGGAATTAAAAC

หมายเหตุ: Y = สามารถสรา งผลผลติ PCR ได, Y* = สามารถสรางผลผลติ แตขนาดของผลผลติ PCR ไมต รงกบั ที่
ออกแบบได และ N = ไมสามารถสรา งผลผลติ PCR ได

71

เอกสารอางองิ
จริ าพร เกษรจันทร, สทิ ธิ บญุ รตั ผลิน เรวตั ร คงประดษิ ฐ และอุษณีย เอกปณธิ านพงศ. 2538. ไวรัสรูป แ ท ง
สาเหตขุ องโรคตวั แดงดวงขาวในกุง กลุ าดำ. เอกสารวิชาการฉบับท่ี 3/2558. สถาบนั วจิ ยั การ เพาะเลี้ยงสัตว
นำ้ ชายฝง สงขลา. 10 หนา.
Gao, F.Y., X. Ye, H. Wang, J.J. Bai, H.H. Lao, Q. Jian and Q.M. Zheng. 2007. Molecular

cloning of Litopenaeus vannamei hemocyte lysozyme. Submitted (DEC-2007) to the
EMBL/GenBank/DDBJ databases.
Ma, T.H., S.H. Tiu, J.G. He and S.M. Chan. 2007. Molecular cloning of a C-type lectin (LvLT)

from the shrimp Litopenaeus vannamei: early gene down-regulation after WSSV
infection. Fish Shellfish Immunol. 23(2), 430-437.
OIE. 2012. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2012: Chapter 2.2.6. White spot
disease. www.oie.int/fileadmin/home/health_standards/aahhm
/current /2.2.06_WSD.pdf.
Reed, R. J. and H. Muench. 1983. A simple method of estimating 50 percent entpoints.
American journal of Hygiene 27: 493-497.
Sellos, D., S. Lemoine and A. Van Wormhoudt. 1997. Molecular cloning of hemocyanin cDNA
from Penaeus vannamei (Crustacea, Decapoda): structure, evolution and physiological
aspects. FEBS Lett. 407(2): 153-158.
Sun, P.S., M. Soderlund, N.C. Venzon, D. Ye and Y. Lu. 2007. Isolation and characterization
of two actins of the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Mar. Biol.
151(6), 2145-2151.
Wang, Y.C., P.S. Chang and H.Y. Chen. 2007. Tissue expressions of nine genes important to
immune defence of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish
Immunol. 23(6), 1161-1177.

คณะผู้จดั ทาํ และเรียบเรยี งขอ้ มูล

นางสาวเจนจติ ต์ คงกําเนดิ ผูเ้ ชย่ี วชาญดา้ นโรคสตั วน์ ํ้า

นางฐิติพร หลาวประเสรฐิ ผอู้ าํ นวยการกองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์นํ้า

นายอมรชยั สมเจตนเ์ ลิศเจรญิ หวั หน้ากล่มุ วชิ าการ

นางสาวจารี ผลชนะ หัวหน้ากล่มุ วจิ ยั และพัฒนาการควบคมุ โรคสตั วน์ ํ้า

นางสาวปรยี านันท์ ศรีวรรณยศ หวั หนา้ กลมุ่ วจิ ัยและพัฒนายาและเคมภี ณั ฑส์ ตั ว์นํ้า

นางสาวพุ ทธรตั น์ เบ้าประเสริฐกลุ หัวหนา้ กลุ่มวจิ ยั และพัฒนาการตรวจสอบและรบั รอง
ฟารม์ สตั วน์ า้ํ เพื่อการสง่ ออก

นางสาวธรี ดา โควาวเิ ศษสุต หัวหน้ากลมุ่ วิจยั ระบาดวทิ ยาโรคสัตวน์ ํา้

นางจําเรญิ ศรี ถาวรสุวรรณ ผ้อู ํานวยการศูนย์วิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ ํ้าสงขลา

นางสาวศศิพร สุขพญา หวั หน้าฝา่ ยบริหารท่วั ไป

เจ้าหน้าท่กี ลมุ่ วิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์นํา้