คู่มือแบคทีเรียและเชื้อรา จัดทำโดย กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข

232 บทท่ี 5 การวินิจฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเช้อื ราท่ีพบบ่อย

เชอ้ื C. albicans สโี คโลนเี ป็นสีเขียวบน CHROMagar Candida มบี าง isolate สโี คโลนจี ะเปน็ สีเขียวเข้ม
เช้ือ C. dubliniensis ส่วนใหญ่สีโคโลนีจะเป็นสีเขียวเข้ม เป็นส่ิงตรวจจาก sterile site เช่นเลือด การพบเชื้อ
C. dubliniensis ในกระแสเลือดพบได้นอ้ ย (rare cases)
รายงานผล การเพาะเชอ้ื “Candida albicans, presumptive identification base on germ tube positive and
bright green colony on CHROMagar Candida.”

2. การวนิ จิ ฉยั Cryptococcus neoformans กอ่ โรค cryptococcosis

หลกั การ Cryptococcus neoformans เปน็ ยีสต์ท่ีสร้างแคปซลู ล้อมรอบเซลล์ การตรวจสดสิ่งตรวจที่
สงสัยโรค cryptococcosis ในอินเดยี องิ ค์ (india ink preparation) ท�ำใหเ้ ห็นเซลล์ยสี ตแ์ ละแคปซูลทลี่ ้อมรอบได้
ชดั เจนเชอื้ ทเ่ี พาะไดบ้ นอาหารเลย้ี งเชอ้ื ตรวจดแู คปซลู ดว้ ยอนิ เดยี องิ คแ์ ลว้ ทำ� การทดสอบureaseเชอื้ มคี ณุ สมบตั ิ
ในการ hydrolyse urea เปน็ ammoniaได้ และนำ� ผลการทดสอบมาประกอบในการวินิจฉัย

ส่ิงตรวจ น�ำ้ ไขสันหลงั เลือด ไขกระดกู เสมหะ น�้ำลา้ งปอด ผิวหนัง ปสั สาวะ ตอ่ มน้�ำเหลอื ง มา้ ม ตบั
ไต ต่อมหมวกไต ตอ่ มลกู หมากและต่อมไทรอยด์เป็นต้น

วิธีปฏบิ ตั ิงาน
1. การตรวจสดสิง่ ตรวจใน india ink ทางกล้องจลุ ทรรศน์
2. การเพาะเชอื้ สง่ิ ตรวจทเี่ ปน็ ของเหลวใชป้ รมิ าตรประมาณ 0.5 ml หยดบน SDA plate ถา้ เปน็ ชน้ิ เนอ้ื
ใช้กรรไกรปราศจากเชื้อตัดเป็นช้ินเล็กๆ และใช้คีมคีบปราศจากเชื้อคีบชิ้นเน้ือแตะลงบนผิวหน้าของอาหาร
เล้ียงเชื้อ ลากเป็นแนวซิกแซกตัดกัน 2 ระนาบตลอดทั่วผิวหน้าของอาหารเล้ียงเชื้อ อบเช้อื ท่อี ณุ หภมู ิ 25-30 OC
ตรวจดูการเจรญิ ของเชอ้ื เม่อื ครบ 48 ชม. ถา้ ยงั ไมพ่ บการเจรญิ ของเชื้อ ใหเ้ กบ็ ไว้ 2 สัปดาหจ์ งึ ทิง้ plate รายงาน
ผล “no fungal growth”
3. การทดสอบ urease ใชล้ ปู ตกั โคโลนขี องเชอ้ื ยสี ตท์ จี่ ะทดสอบstreak ลงบนผวิ หนา้ ของ Christensen’s
urea agar slant อบเช้ือที่อุณหภมู ิ 25-30 OC และ 37 OC เวลา 24-48 ชม.
เชอื้ ควบคุมคณุ ภาพ positive control Cryptococcus neoformans DMST 15319
negative control Candida albicans DMST 15313

ค่มู อื การปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

บทท่ี 5 การวินจิ ฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชื้อราท่พี บบ่อย 233

การอ่านผล
การตรวจสดสิ่งตรวจในอนิ เดียอิงคท์ างกลอ้ งจลุ ทรรศน์ (ดใู นบทที่3)
การเพาะเชื้อ ลักษณะโคโลนีบน SDA มีลักษณะเปียกเป็นมูก ผิวหน้าเรียบเป็นมัน โคโลนีสีขาวและ
สเี ขม้ ขน้ึ เปน็ สแี ทนเมอ่ื อายมุ ากขนึ้ บางครงั้ จะพบลกั ษณะโคโลนที แ่ี หง้ แสดงวา่ เชอื้ ไมส่ รา้ งแคปซลู หรอื สรา้ งได้
บางมาก ลักษณะของเชื้อจากการตรวจสดในอินเดียอิงค์ทางกล้องจุลทรรศน์ จะเห็นรูปร่างยีสต์และแคปซูล
แบบเดยี วกนั แตแ่ คปซลู บางกวา่ ทตี่ รวจพบในส่ีงตรวจ
การทดสอบ urease สขี อง urea agar เปลยี่ นเปน็ สชี มพเู ขม้ ทงั้ 2 อณุ หภมู ิ แสดงวา่ เชอื้ ทท่ี ดสอบสามารถ
hydrolyse urea เป็น ammonia ได้ อ่านผล urease บวก สขี อง urea agar ไมเ่ ปล่ยี นสีอ่านผล urease ลบ ทง้ั นี้
เปรยี บเทยี บผลกบั positive และ negative control เชอื้ ยสี ตท์ สี่ รา้ งแคปซลู และใหผ้ ล urease บวก นอกเหนอื จาก
Cryptococcus neoformans ได้แก่ Cryptococcus spp. และ Rhodotorula spp. แต่มีรายงานการก่อโรคในคน
ค่อนขา้ งตำ�่ เมือ่ เปรียบเทียบกบั Cryptococcus neoformans

การรายงานผล 5บทที่
การตรวจสดสิ่งตรวจใน india ink ตรวจพบ encapsulated yeast cells
รายงานผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”
หรือ “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”
การเพาะเช้ือ รายงานผล “Cryptococcus neoformans, presumptive identification base on budding,
encapsulated yeast cells and urease positive of primary culture.”

ข้อเสนอแนะเพิม่ เติมสำ� หรบั rapid identification ของเชอ้ื Cryptococcus neoformans

การวินิจฉัยเชื้อ Cryptococcus neoformans น้ันอย่างน้อยห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาลศูนย์และ
โรงพยาบาลทั่วไปต้องท�ำการเพาะเชื้อ ท�ำ india ink preparation และทดสอบ urease ของ primary culture
แต่ถ้าเพ่ิมการทดสอบ phenoloxidase จะท�ำให้การรายงานผลมีความแม่นย�ำถูกต้องสูงข้ึน ห้องปฏิบัติการ
แห่งใดสนใจทดสอบเพิ่มเติมขอให้ติดต่อสอบถามได้ที่ ฝ่ายเชื้อราวิทยา สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข
กรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ โทร. 02 5899850 ต่อ 99405 โทรสาร 02 5915449

การทดสอบ phenoloxidase

Phenoloxidase activity เป็นคุณสมบัติเฉพาะของ Cryptococcus neoformans ที่แตกต่างจาก
Cryptococcus spp. และยสี ตก์ อ่ โรคอน่ื ๆ คือเชอ้ื สร้างเอนไซม์ phenoloxidase ได้ (Cryptococcus บาง species
สรา้ งเอนไซม ์ phenoloxidaseไดแ้ ตส่ รา้ งไดใ้ นปรมิ าณทน่ี อ้ ยกวา่ C.neoformans)เอนไซมช์ นดิ นเ้ี ปน็ ตวั เรง่ ในการ

คูม่ ือการปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา

234 บทท่ี 5 การวนิ ิจฉยั แบคทีเรียกอ่ โรคกล่มต่างๆและเชื้อราท่ีพบบ่อย

เปลยี่ นsubstrate ทเี่ ปน็ สารพวกphenolic compoundsเชน่ caffeic acid, DOPA (dihydroxyphenylalanine) ใหเ้ ปน็
melanin like pigment การทดสอบ phenoloxidase สามารถทำ� การเพาะเชอ้ื ลงบนอาหารเลยี้ งเชอ้ื ทเ่ี ตมิ phenolic
compounds เพอื่ ใช้ทดสอบ phenoloxidase activity ไดแ้ ก่ DOPA medium modified caffeic acid-cornmeal agar
และ sunflower seed agar โคโลนีของเชื้อ C. neoformans ที่เจรญิ บนอาหารเลย้ี งเชอื้ ทเี่ ติม phenolic compounds
จะเปน็ โคโลนี สนี ำ้� ตาลอา่ นผลเปน็ phenoloxidase บวก หรอื ทำ� การทดสอบโดยใชแ้ ผน่ ทดสอบ phenoloxidase
ฝา่ ยเชอื้ ราวทิ ยา สถาบนั วจิ ยั วทิ ยาศาสตรส์ าธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ ทำ� การทดสอบ phenoloxidase
โดยใช้ sunflower seed agar (ระยะเวลาท่ีอ่านผลภายใน 24 ชม.) และแผ่นทดสอบ phenoloxidase โดย phenolic
compounds ท่ีใช้คือ สารสกัดจากเมล็ดทานตะวัน (ผลการทดสอบ เห็นสีน้�ำตาลถึงสีน�้ำตาลเข้มท่ีภายใน
4 ชม.) sunflower seed agar ราคาถกู และหาได้ง่ายในประเทศ ซง่ึ หอ้ งปฏิบัตกิ ารของโรงพยาบาลทัว่ ประเทศ
สามารถนำ� ไปใชท้ ดสอบเพม่ิ ไดโ้ ดยจะไมก่ ระทบกบั ราคาคา่ ตรวจเดมิ แตเ่ พมิ่ คณุ คา่ และคณุ ภาพของการบรกิ าร
ใหแ้ ก่แพทยผ์ ใู้ ห้การรักษารวมทั้งผ้ปู ่วยดว้ ย

3. การวนิ ิจฉยั Penicillium marneffei กอ่ โรค penicillosis marneffei

หลักการ Penicillium marneffei เป็นรา 2 รูป (dimorphic fungi) ซ่ึงโดยปรกติเมื่อเจริญอยู่ในดิน
หรือในส่ิงแวดล้อมอื่นๆท่ีอุณหภูมิไม่เกิน 30 OC จะมีลักษณะรูปร่างเป็น mold phase เมื่อถูกสูดดมเข้าไป
ในปอด อณุ หภูมเิ ปลีย่ นเป็น 37 OC เชือ้ จะปรับตวั เขา้ กบั สภาพแวดล้อมใหม่โดยเปลี่ยนรูปรา่ งเป็นยีสต์ในภาวะ
ทกี่ อ่ โรค การตรวจสง่ิ ตรวจโดยตรงโดยการยอ้ มสแี กรม ยอ้ มสี Giemsa หรอื ยอ้ มสี Wright และตรวจดดู ว้ ยกลอ้ ง
จลุ ทรรศนท์ ำ� ใหเ้ หน็ ยสี ตเ์ ซลลข์ อง P. marneffei ไดช้ ดั เจนและแยกออกไดง้ า่ ยขนึ้ การทดสอบรา 2 รปู เชอ้ื เปลย่ี น
จาก mold phase ท่ี 25-30 OC เป็น yeast phase ท่ี 37 OC ได้

สิ่งตรวจ เลือด ไขกระดูก ผิวหนัง น้�ำคัดหล่ังจากระบบทางเดินหายใจ ตับ ต่อมน้�ำเหลือง อุจจาระ
นำ�้ ไขสันหลัง กระเพาะอาหารหรอื ล�ำไสเ้ ลก็ และมา้ ม เป็นตน้

วิธปี ฎบิ ัติงาน
1. การตรวจสงิ่ ตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์ การยอ้ มสแี กรม การยอ้ มสี Giemsa การยอ้ มสี Wright
ตรวจดดู ว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ กำ� ลังขยาย 10 X และ 100 X อย่างน้อยทีส่ ดุ ขอใหท้ �ำการย้อมสแี กรม
2. การเพาะเชอ้ื อาหารเลย้ี งเชอื้ ใช ้ SDA และ BHI agar อบเชอื้ ทอ่ี ณุ หภูมิ 25-30 OC ตรวจดูการเจริญ
ของเช้อื เมอ่ื ครบ 48 ชม. และตรวจดกู ารเจริญทกุ 2-3 วนั รอจนเช้อื เจรญิ สง่ ตอ่ ตรวจวนิ ิจฉัย/ ยนื ยัน (definitive
identification) ท่สี ถาบนั วจิ ยั วทิ ยาศาสตรส์ าธารณสุข กรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา

บทที่ 5 การวินิจฉยั แบคทเี รยี กอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชือ้ ราทพ่ี บบ่อย 235

การอา่ นผล 5บทที่
การย้อมแกรมเซลล์ยีสต์ติดสีแกรมบวก การย้อมสี Giemsa และการย้อมสี Wright ติดสีไม่สม�่ำเสมอ
ส่วนของ polar ติดสีน้�ำเงินเข้ม จะเห็นนิวเคลียส 2 นิวเคลียสชัดเจนในเซลล์ยีสต์ ส่วนของผนังตัดขวาง
เซลล์ไมต่ ิดสี
เซลล์ยีสต์ของ P. marneffei ตรวจพบได้ท้ังภายในและภายนอก histiocytes รูปร่างและขนาดของ
เซลลย์ ีสต์มีความหลากหลาย ไดแ้ ก่ เซลล์รูปกลมหรือรูปไข่ขนาดประมาณ 2-3 µm เซลลร์ ูปยาวรี (elongated
cells) ขนาดประมาณ 2-3 X 2-6.5 µm ตรวจพบภายใน histiocytes เซลล์ยสี ต์ภายนอก histiocytes พบเซลล์
รปู ยาวคลา้ ยไส้กรอก (sausage-shaped) ความยาว 8-13 µm อาจพบเซลลย์ สี ตท์ เี่ ปน็ ทอ่ นโคง้ งอคลา้ ยกลว้ ยหอม
เซลล์ยีสตข์ อง P. marneffei เพมิ่ จ�ำนวนโดยการสรา้ งผนังตดั ขวางเซลล์ (binary fission) ซึง่ เปน็ ลกั ษณะเฉพาะ
ของ P. marneffei
รูปร่างและขนาดของเซลล์ยีสต์ท่ีอยู่ภายใน histiocytes มีความแตกต่างกับเซลล์ยีสต์ท่ีอยู่ภายนอก
histiocytes เซลล์ยีสต์ที่อยู่ภายใน histiocytes จะมีรูปร่างที่เหมือนกันทุกเซลล์และขนาดใกล้เคียงกัน
ซึ่งอาจจะเป็นรูปกลม รูปไข่ หรือรูปยาวรี ซ่ึงจะใกล้เคียงกับเซลล์ยีสต์ Histoplasma capsulatum ท�ำให้เกิด
การสับสนไดต้ อ้ งตรวจหาลกั ษณะเฉพาะ binary fission yeasts ของ P. marneffei และ budding yeasts ของ
H. capsulatum ให้พบ ในกรณีท่ีตรวจไม่พบลักษณะเฉพาะของเช้ือ ต้องด�ำเนินการเพาะเชื้อเพื่อช่วยใน
การวินจิ ฉัย
การเพาะเช้ือ โคโลนีมีลักษณะเป็นจุด คล้ายขี้ผึ้งสีแดง จะปรากฏให้เห็นหลังจากเพาะเชื้อได้ 2 วัน
ต่อมาสร้างเส้นใยเป็นปุยสีขาวและสร้างสารสีแดงละลายในเน้ือวุ้น ผิวหน้าโคโลนีจะเปล่ียนเป็นผงละเอียด
สีชมพูเมื่อเช้ือมีอายุการเจริญได้ 7 วัน การสร้างสารสีแดงละลายในเน้ือวุ้นของ Penicillium marneffei
บางครั้งอาจสรา้ งได้นอ้ ยมากหรือไมส่ รา้ งเลยบน primary culture, SDA, Lowenstein-Jensen medium หรือ CA
ซึง่ อาจท�ำให้เข้าใจผดิ ได้ว่าเป็น contaminated mold ได้

การรายงานผล

รายงานผลการตรวจส่ิงตรวจทางกล้องจลุ ทรรศน์ “Binary fission yeasts, Penicillium marneffei”
กรณที ไี่ มพ่ บลักษณะเฉพาะรายงานผล “Round yeast cells, oval yeast cell suggesting Penicillium
marneffei or Histoplasma capsulatum”

คูม่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรียและรา

236 บทท่ี 5 การวินิจฉัยแบคทีเรยี ก่อโรคกล่มต่างๆและเช้อื ราที่พบบอ่ ย

4. การวนิ ิจฉัย Histoplasma capsulatum ก่อโรค histoplasmosis

หลักการ การย้อมแกรม การย้อมสี Giemsa การย้อมสี Wright จะท�ำให้ เซลล์ยีสต์ของ Histoplasma
capsulatum มีการติดสีท่ีจ�ำเพาะ ท�ำให้ตรวจพบและแยกออกจากลักษณะอ่ืนๆในส่ิงตรวจได้ง่ายขึ้น การ
ตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการเพาะเชื้อเพ่ือตรวจดูลักษณะโคโลนีท่ีมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า จะแสดง
ลักษณะของ H. capsulatum ซึ่งคล้อยตามกับลักษณะรูปร่างของเซลล์ยีสต์ท่ีตรวจพบจากการย้อมสีส่ิงตรวจ
โดยตรง H. capsulatum เป็นรา 2 รูปเช่นเดยี วกบั P. marneffei เชือ้ เปลี่ยนจาก mold phase ที่ 25-30 OC เปน็
yeast phase ที่ 37 OC ได้

ส่งิ ตรวจ ไขกระดูก เลือด นำ�้ คดั หลั่งจากระบบหายใจ ต่อมนำ้� เหลอื ง ตบั แผลทีผ่ วิ หนงั น�้ำไขสันหลัง
และสมอง

วิธปี ฎบิ ตั ิงาน
1. การตรวจสิง่ ตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์ การยอ้ มแกรม การยอ้ มสี Giemsa การยอ้ มสี Wright
ตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ กำ� ลังขยาย 10 X และ 100 X อย่างนอ้ ยทีส่ ุดขอใหท้ ำ� การย้อมแกรม
2. การเพาะเชื้อ อาหารเล้ียงเชื้อใช้ SDA, BHA agar อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 25-30 OC ตรวจดู
การเจริญของเช้ือหลังจากเพาะเช้ือได้ 3 วัน และหลังจากน้ันตรวจดูการเจริญทุก 2-3 วัน รอจนเชื้อเจริญ
ส่งต่อตรวจวินจิ ฉยั /ยนื ยนั (definitive identification) ที่ สถาบนั วจิ ยั วทิ ยาศาสตร์สาธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตร์
การแพทย์

การอา่ นผล
การยอ้ มแกรม เซลลย์ สี ตต์ ดิ สแี กรมบวก การยอ้ มสี Giemsa และการยอ้ มสี Wright การตดิ สไี มส่ มำ่� เสมอ
สว่ นของ cytoplasm ตดิ สนี ำ้� เงินออ่ น และส่วนของ polar ติดสนี ำ้� เงนิ เข้ม
ตรวจพบเซลล์ยีสต์รูปกลม รูปไข่ มี budding cells ขนาดของเซลล์ประมาณ 3-5 µm เซลล์ยีสต์
มขี นาดทเ่ี ทา่ กันและรปู รา่ งสม�่ำเสมอเหมือนกนั เจริญอย่ภู ายใน macrophage ขนาดใหญ่หรือ giant cells
การเพาะเชอื้ H. capsulatum มกี ารเจรญิ เตบิ โตชา้ หลงั จากเพาะเชอ้ื ไดป้ ระมาณ 3 สปั ดาห์ จะพบลกั ษณะ
โคโลนเี ปน็ ปยุ นนุ่ สขี าวและสเี ขม้ ขนึ้ เปน็ สนี ำ�้ ตาลออ่ นเมอ่ื เชอื้ มอี ายมุ ากขน้ึ ทางดา้ นลา่ งของโคโลนเี ปน็ สนี ำ้� ตาล

การรายงานผล รายงานผลการตรวจส่งิ ตรวจทางกลอ้ งจุลทรรศน์ “Round or oval yeast cells, budding
yeast cells suggesting Histoplasma capsulatum.”

คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทีเรยี กอ่ โรคกลม่ ต่างๆและเชอ้ื ราทพ่ี บบ่อย 237

เอกสารอา้ งอิง 5บทที่

1. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Introduction to Medical Mycology. In: Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia, PA: Lippincott
Williams & Wilkins; 2008. p.489-506.
2. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In :
Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases : Essentials of Diagnostic Microbiology.
Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins;2008. p. 507-540.
3. Hazen KC and Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing. In: Garcia LS.
editor in chief. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 2. Washington, DC:
ASM Press; 2007 Update. p. 8.3.1.1- 8.6.10.
4. Howell SA, and Hazen KC. Candida, Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance.
In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor.
Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 1793-
821.
5. Peng CF, Lee KM, Lee SH. Characterization of Two Chromogenic Media of Candida ID2 and
CHROMagar Candida for Preliminary Identification of Yeasts. J Biomed Lab Sci 2007;19(2):
63-69.

คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรียและรา



บทที่ 6
การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจลุ ชีพ

สวุ รรณา ตระกลู สมบูรณ์
วนั ทนา ปวณี กิตติพร
สรุ างค์ เดชศริ เิ ลศิ

หลกั การ 6บทที่
การทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อสารต้านจุลชีพ เป็นการทดสอบทางห้องปฏิบัติการเพื่อบ่งช้ีว่า
แบคทีเรียก่อโรคที่แยกได้จากสิ่งตรวจไวหรือดื้อต่อสารต้านจุลชีพใด เพ่ือเป็นแนวทางส�ำหรับแพทย์ในการ
เลือกใช้สารต้านจุลชีพในการรักษาผู้ป่วยอย่างมีประสิทธิภาพ วิธีการทดสอบมีหลายรูปแบบทั้งการวิเคราะห์
เชิงคุณภาพและการวิเคราะห์เชิงปริมาณ นอกจากน้ียังมีการตรวจหาเอนไซม์ที่ท�ำลายสารต้านจุลชีพซ่ึง
ผู้ปฏิบัติงานควรพิจารณาเลือกใช้การทดสอบที่เหมาะสม ให้ท�ำการทดสอบกับเชื้อก่อโรคท่ีไม่สามารถคาด
ได้ว่าไวหรือดื้อต่อยา ในกรณีติดเช้ือแบคทีเรียที่ทราบแน่ชัดว่าไวต่อยาท่ีใช้รักษาเสมอ ก็ไม่จ�ำเป็นต้องท�ำ
การทดสอบกบั ยาชนิดนัน้ ได้แก่ Streptococcus pyogenes ไวต่อ penicillin เป็นตน้ ยกเว้นทดสอบเพอ่ื ติดตาม
เฝ้าระวังการดื้อยา หรือกรณที ีส่ งสยั ว่าเปน็ เช้อื ดอื้ ยาทอี่ ุบตั ใิ หม่

วธิ ีการทดสอบ
การทดสอบและการแปลผลของวิธีในบทน้ี ด�ำเนินตามมาตรฐานของ Clinical Laboratory Stan-
dard Institute (CLSI) ส�ำหรับเช้ือแบคทีเรียเจริญเร็ว (rapid growing bacteria) เชื้อแบคทีเรียเจริญยากและ
ช้า (fastidious bacteria) และแบคทีเรียไร้อากาศ (anaerobes) หาก CLSI มีหลักฐานทางวิชาการใหม่ที่จะ
ต้องปรับปรุงวิธีการหรือการแปลผลจะมีการแจ้งการปรับปรุงในเอกสารที่พิมพ์ใหม่ทุกปี ดังน้ันเป็นความ
รบั ผดิ ชอบของผ้ปู ฏิบตั ิงานทีจ่ ะต้องติดตามเอกสารของ CLSI ใหเ้ ป็นฉบับปจั จบุ นั เสมอ วิธีการทดสอบท่ีทำ�
ในห้องปฏบิ ตั กิ ารมีดงั น้ี
1 Disk diffusion หรอื Kirby Bauer’s method
2 MIC determination by broth dilution
3 β-lactamase tests
4 Extended-spectrum β-lactamases (ESBL) detection
5 Carbapenemases (carbapenem-resistant Enterobacteriaceae) detection
6 Screen test to detect high-level aminoglycoside resistance in enterococci

240 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รยี ต่อสารต้านจุลชีพ

7 Agar screening to detect vancomycin resistance in enterococci
8 Agar screening to detect vancomycin resistance in staphylococci
9 D-test
10 E-test

1. วธิ ีการทดสอบความไวโดยใชแ้ ผ่นยา (วิธี Disk diffusion หรือ Kirby Bauer’s)
1.1 หลกั การ วธิ ี Disk susceptibility เป็นการทดสอบเชิงคุณภาพ รายงานผลไว ค่อนข้างไว หรอื ดือ้ ตอ่
สารต้านจุลชีพ เป็นวิธีทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพของแบคทีเรียก่อโรคชนิดเจริญไว (rapidly-growing
aerobic pathogens) และชนิดเจริญยากบางชนดิ (fastidious bacteria) โดยใช้วิธีมาตรฐานของ CLSI ฉบบั M02-
A10 และ M45-A2 ตามล�ำดบั ทดสอบโดยป้ายเชอื้ แบคทเี รียบนผวิ ของวนุ้ อาหารเล้ยี งเชื้อ วางแผ่นยาทดสอบ
อบเชื้อตามเวลาที่ก�ำหนด วัดเส้นผ่านศูนย์กลางของบริเวณที่ไม่มีเชื้อเจริญรอบแผ่นสารต้านจุลชีพเทียบกับ
ตารางแปลผลตามมาตรฐานของ CLSI (M100-S24)
1.2 วิธีปฏบิ ัติ
เลอื กโคโลนขี องเชอื้ ทจี่ ะทดสอบ และเขย่ี เชอ้ื ทขี่ น้ึ บนอาหารทไี่ มใ่ ช่ selective media เพอื่ ทำ� การทดสอบ
ความไวตอ่ สารต้านจุลชีพ
1.2.1 ชนิดของแบคทเี รียที่ทดสอบได้ด้วยวธิ ี Disk diffusion
แบคทีเรียก่อโรคชนิดเจริญไว (rapidly-growing aerobic pathogens) ดังนี้ แบคทีเรียในวงศ์
Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Burkholderia cepacia, Enterococcus spp.,
Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus spp., Aeromonas spp. (A. caviae complex, A. hydrophila
complex และ A. veronii complex), Plesiomonas shigelloides, Moraxella catarrhalis, Pasteurella spp. และ
Vibrio spp.
แบคทเี รียก่อโรคชนิดเจรญิ ช้าหรือเจริญยากบางชนิด (fastidious bacteria) ดงั น้ี Haemophilus
influenzae, H. parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis (ยกเว้นทดสอบต่อยาต่อไปน้ีด้วย
วิธี dilution test : penicillin, ampicillin, cefotaxime หรือ ceftriaxone, meropenem และ azithromycin),
Campylobacter jejuni/coli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. β-hemolytic group (ยกเวน้ ทดสอบ
ยาตอ่ ไปนดี้ ว้ ยวธิ ี dilution test : penicillin หรอื ampicillin, cefepime หรอื cefotaximeหรอื cetriaxone,doripenem,
ertapenem, meropenem และ daptomycin), Streptococcus spp. viridans group (ยกเวน้ ทดสอบยาตอ่ ไปนด้ี ว้ ยวธิ ี
dilution test: penicillin หรอื ampicillin, doripenem, ertapenem, meropenem และ daptomycin)

ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รียและรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี 241

1.2.2 การเลอื กชนดิ ของแผน่ สารตา้ นจลุ ชพี เพ่ือใช้ในการทดสอบประจำ� วันและการรายงาน
การเลือกชนิดของสารต้านจุลชีพที่เหมาะสม ต้องเกิดจากการพิจารณาร่วมกันระหว่าง
ห้องปฏบิ ตั ิการ องค์กรแพทย์ และเภสัชกรรม ตารางที่ 6.1 เปน็ ยาทดสอบทีแ่ นะน�ำส�ำหรับเช้อื แต่ละกล่มุ
- ยากลุ่ม Primary เป็นยาที่ใช้ทดสอบในงานประจ�ำวันเป็นล�ำดับแรก และรายงานทุกยา
ทที่ ดสอบ
- ยากลมุ่ Supplement 1 เปน็ ยาที่ทดสอบเปน็ ลำ� ดบั แรกและเลือกรายงาน เฉพาะกรณเี ช้อื
ที่ด้ือยา primary ท่ีเป็นยา class เดียวกัน หรือในกรณีผู้ป่วยแพ้ยาในกลุ่ม Primary หรือ
รายงานเพอ่ื ช่วยในการควบคมุ การระบาด
- ยากลุ่ม Supplement 2 เป็นยาที่ควรทดสอบเพ่ิมเติมส�ำหรับเชื้อท่ีไวต่อยาใน primary/
supplement 1 น้อยลง (reduce susceptibility) หรือ เชื้อท่ีด้ือยาหลายชนิดพร้อมกัน
(multidrug resistance)
- ยากลุ่ม Urine ประกอบด้วยสารต้านจุลชีพที่ใช้ทดสอบเบื้องต้นส�ำหรับเชื้อก่อโรคที่
แยกได้จากทางเดนิ ปสั สาวะ

ตารางท่ี 6-1 การเลอื กสารต้านจลุ ชีพท่ีทดสอบกบั เช้ือแบคทีเรยี แตล่ ะชนดิ 6บทที่

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Staphylococcus spp. Cefoxitin 1-1 Norfloxacin
Erythromycin 1-2 Teicoplanin Linezolid Nitrofurantoin
Clindamycin 1-2, 1-3 Ciprofloxacin Moxifloxacin
Gentamicin or Levofloxacin
Trimethoprim- Fosfomycin
sulfamethoxazole Fusidic acid
MIC of
Vancomycin 1-4

S. pneumoniae Penicillin 2-1 Vancomycin Linezolid
(Oxacillin disk) Levofloxacin Rifampin
β-haemolytic Erythromycin MIC of Penicillin 2-1, 2-2 Tigecycline
Streptococcus 3-1 Clindamycin 1-3 MIC of Cefotaxime 2-1, 2-2
Streptococcus spp. Trimethoprim- or Ceftriaxone 2-1, 2-2
viridans group 4-1 sulfamethoxazole or Meropenem 2-1, 2-2
Penicillin 3-2
Erythromycin 1-.2 Levofloxacin
Clindamycin 1.2, 1-3 Cefotaxime
MIC of Penicillin 4-2 or Ceftriaxone

Cefotaxime
Ceftriaxone
Erythromycin
Clindamycin 1-2, 1-3
Vancomycin

คู่มอื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

242 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจุลชพี

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Enterococcus spp. 5-1 Penicillin 5.2 Vancomycin 5-4 Linezolid Norfloxacin
Enterobacteriaceae 6-1 or Ampicillin or Teicoplanin Tigecycline or Ciprofloxacin
Gentamicin 5-3 Streptomycin 5-3 or Levofloxacin
Shigella spp. 7 (120 μg) (300 μg) Nitrofurantoin
Salmonella spp. 7 β-lactamase test Cefuroxime
Vibrio cholerae Ampicillin Cefotaxime 6-2 Norfloxacin
Vibrio spp.* Amoxicillin- or Ceftriaxone 6-2 Ofloxacin
Aeromonas spp.* clavulanic acid Cefoperazone Nitrofurantoin
Ampicillin-sulbactam Cefepime
Campylobacter Cefoxitin Amikacin
jejuni/coli * Gentamicin Ertapenem 6-3
Trimethoprim- Imipenem 6-3
sulfamethoxazole Meropenem 6-3
Ciprofloxacin Doripenem

Ampicillin Cefotaxime or
Trimethoprim- Ceftriaxone 8-2
sulfamethoxazole Levofloxacin 8-1
Ciprofloxacin MIC of Ciprofloxacin
or Norfloxacin
Ampicillin
Trimethoprim-
sulfamethoxazole
Nalidixic acid 8-1
Ciprofloxacin
or Norfloxacin 8-1
Ampicillin
Tetracycline
Trimethoprim-
sulfamethoxazole
Ciprofloxacin
Cefotaxime
Ceftazidime
Tetracycline
Fluoroquinolone
Amoxicillin-clavulanic
acid
3rd or 4th generation
cephalosporins
Fluoroquinolones
Trimethoprim-
sulfamethoxazole
Erythromycin
Ciprofloxacin

คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทเี รยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารต้านจุลชพี 243

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Pasteurella spp.* Netilmicin NorfOlofxloaxcaincin
Penicillins Piperacillin- MDTiogICxeycocyfyc cl Nilnineeteilmicin
Pseuaderoumgoinnoassa β -lacintahmib/itβo-rlaccotmambiansaetions Cefotapzeorabzaocntaem-
Acinetobacter spp. Cephalosporins sulbactam 9 Meropenem
TMeatrcarcoylicdleinses CefeoprimCeefpirome
Stenmoatrlotopphhoimliaonas Fluoroquinolones Imipenem
Burkphsoeulddeormiaallei T rimseutlhfaompreitmho- x a zole MDoerrioppeenneemm

B urkcheopladceiaria ACCGeiempfnrtitakoazafmlicdoiiixcnmiancein
Haemophilus
CAGCC eeimepffnrtopCtaoatizacfemlixifdoltiilrixmciminiaane-cxesioounrnl be actam TPirpimereatchiollpinri-mta-z o b actam
influenzae 11-1 sulfamethoxazole
(CSF isolate) Cefospuelbraazcotanme-9
H a e(irmnefsolppuihernailtzuoasrey1i1s-1olate) Cefepime or
H . pa(rnaerdsapinirfaltuoernyziaseol1a1-t1e) ImipCeenfepmirome
Meropenem
MAmICikoafciCnolistin10

Trimseutlhfaompreitmho- xazole Levofloxacin 6บทท่ี

MMMM M IIIIICCCCC o TooooorrifffffDm T csoICAeulmexatelmthyvfrfiapoatcuoamcepylxzaynrcieinicceldtmiiilhminclimol-nei axen e ca- i zd ole

Trimseutlhfaompreitmho- x a zole CMeefrtoazpiedniemme

Ampicillin CMeefroootrpaxeCniemefmrei a xone
(β-lactamase test) 11-2

Ampicillin test) 11-2 ACizpirtohorrfolComxlayarccitiihnnr o m y cin
A m o (xβi-clailclitnam- ase
oclraAvsumulalpbniacicciltalaicnmi-d oorr MLeovxoiffllooxxaacciinn

Trimseutlhfaompreitmho- x a zole

คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรยี และรา

244 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Neisseria meningitidis Cefotaxime (Only for prophylaxis: Nalidixic acid 12
or Ceftriaxone Azithromycin
Meropenem Trimethoprim-
MIC of Penicillin sulfamethoxazole
Rifampin
Ciprofloxacin)

Moraxella catarrhalis β-lactamase test
Amoxicillin-clavulanic
acid
MIC of Cefaclor
or Cefuroxime
Trimethoprim-
sulfamethoxazole

Primary = ยาท่ีควรทดสอบเปน็ ล�ำดับแรก และ รายงานทุกยาท่ีทดสอบ
Supplement 1 = ยาท่ีควรทดสอบเป็นล�ำดับแรกและเลือกรายงาน เฉพาะกรณีเชื้อที่ดื้อยา primary
ท่เี ปน็ ยา class เดียวกนั
Supplement 2 = ยาท่ีควรทดสอบเพิ่มเติมส�ำหรับเชื้อที่ reduce susceptibility ต่อยาใน primary/
supplement 1 หรือ เชอื้ ทด่ี ้ือยาหลายชนดิ พร้อมกัน (multidrug resistance)

คำ� อธิบายตารางที่ 6-1 :

1-1 . การทดสอบ oxacillin หรือ methicillin resistance ของ Staphylococcus spp. ใหท้ ดสอบด้วย แผน่ ยา
cefoxitin (ห้ามใช้แผ่นยา oxacillin)
1-2. การทดสอบหาการดื้อยา clindamycin ที่เกิดจากการเหน่ียวน�ำของยา erythromycin สามารถท�ำโดย
การวางแผ่นยา erythromycin ใกล้กับแผ่นยา clindamycin (ระยะห่างจากขอบถึงขอบ 15-20 mm
ส�ำหรับการทดสอบเชื้อ staphylococci และ 12 mm ส�ำหรับ β-haemolytic streptococci) เชื้อที่ให้
inhibition zone ของ clindamycin ด้านท่ีติดกับ erythromycin แบนแคบลง มองเห็นเป็นตัวอักษร D
คอื เชือ้ ทีเ่ กดิ การดือ้ clindamycin แบบเหนย่ี วน�ำ (inducible clindamycin resistance) ให้รายงานว่า ดอื้
clindamycin ถึงแมว้ า่ ผลการทดสอบไวต่อแผน่ ยา clindamycin
1-3. ไม่รายงานผลการทดสอบ clindamycin ต่อเช้ือ staphylococci, β-haemolytic streptococci และ
Streptococcus spp. viridans group ทพี่ บในระบบทางเดนิ ปัสสาวะ
1-4. ควรทดสอบหา MIC ของยา vancomycin ต่อเช้ือ MRSA ท่ีแยกได้จาก sterile site หากต้องการ
ทดสอบจาก specimen อ่ืน อาจพจิ ารณาเป็นรายๆไป

ค่มู ือการปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจลุ ชพี 245

2-1. หากเช้ือ S. pneumoniae จาก sterile site ทใี่ ห้ inhibition zone ต่อ oxacillin (1 μg) < 19 mm ใหท้ ดสอบ

และรายงานผล MIC ตอ่ penicillin และ cefotaxime หรือ ceftriaxone เสมอ

2-2. เชื้อ S. pneumoniae ท่ีแยกได้จาก CSF ใหท้ ดสอบและรายงานผล MIC ตอ่ penicillin และ cefotaxime

หรือ ceftriaxone หรือ meropenem รวมทั้งทดสอบและรายงานผล MIC หรือ disk diffusion ต่อยา

vancomycin ดว้ ย

3-1. β-haemolytic Streptococcus spp. ในทน่ี หี้ มายถงึ β-haemolytic Streptococcus group B (S. agalactiae)

และ β-haemolytic Streptococcus ทีม่ ีโคโลนขี นาดใหญ่ ใน group A (S. pyogenes), C, G

3-2. ในต่างประเทศยังไม่มีรายงานการด้ือ penicillin ของเช้ือ β-haemolytic Streptococcus หากพบว่า

เช้ือนี้มีการดื้อ penicillin จากการทดสอบโดยวิธี disk diffusion ให้ท�ำการทดสอบชนิดเชื้อซ้�ำ และ

ทดสอบความไวโดยหา MIC หรือส่งเช้ือทดสอบยืนยันไปยงั กรมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์

4-1. Streptococcus spp. viridans group ในทนี่ หี้ มายถึงเชือ้ Streptococcus spp.ท่ีอยู่ในกลุม่ S. mutans group,

S. salivarius group, S. bovis group, S. anginosus group (ชอ่ื เดิม “S. milleri” group) และ S. mitis group

รวมถงึ β-haemolytic Streptococcus spp. ทม่ี ีนคิ มขนาดเล็กไดแ้ ก่ group A, C, F หรือ G

4-2. ทดสอบหา MIC ของ penicillin ต่อ Streptococcus spp. viridans group ท่แี ยกไดจ้ าก sterile site

5-1. Enterococcus spp. ไม่ควรทดสอบความไวต่อยาในกลุ่ม cephalosporins, aminoglycosides (ยกเว้น 6บทท่ี

high-level), clindamycin และ trimethoprim-sulfamethoxazole เพราะผลในหลอดทดลองไม่
สอดคลอ้ งกบั ผลการรักษา
5-2. ผลการทดสอบความไวของเชื้อ Enterococcus spp. ต่อ penicillin สามารถพยากรณ์ความไวของเชื้อนี้

ต่อยา ampicillin ได้ดว้ ย

5-3. การทดสอบความไวของ Enterococcus ตอ่ ยากลุ่ม aminoglycosides ใหใ้ ช้ยาชนดิ ที่มีความเขม้ ขน้ สงู

(highlevel)ไดแ้ ก่gentamicin120µgและ streptomycin 300µg หากแปลผลไดด้ อ้ื ยาหมายถงึ ยาทท่ี ดสอบ

ไมเ่ สรมิ ฤทธกิ์ บั ยากลมุ่ cell wall-active (ได้แก่ ampicillin, penicillin, vancomycin หากแปลผลไวต่อยา

หมายถึงยาท่ีทดสอบเสริมฤทธิ์กับยากลุ่ม cell wall-active และหากแปลผลเป็น intermediate

ไม่สามารถสรปุ ได้ ตอ้ งทำ� การทดสอบดว้ ยวธิ ี MIC

5-4. Enterococcus spp. ที่ให้ผล vancomycin intermediate หรือ resistant ให้ทดสอบยืนยันด้วยการท�ำ

vancomycin agar screen plate โดยใช้ BHI agar ที่เติม vancomycin 6 µg/ml หรือหา MIC ต่อ

vancomycin

6-1. CLSI ได้ปรับมาตรฐานการแปลผลของ inhibition zone และ MIC breakpoints ของ cefazolin,

ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime และ aztreonam ตามผลการรักษาด้วยยาขนาด 2 g ทุก 8 ชม.,

1 g ทุก 24 ชม., 1 g ทุก 8 ชม., 1 g ทกุ 8 ชม., 1 g ทกุ 8 ชม. ตามลำ� ดับ

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

246 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารตา้ นจุลชีพ

การอ่าน การแปล และรายงานผลการทดสอบความไวของยากลุ่ม cephalosporins (cefazolin,
ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime) และ aztreonam ต่อเชื้อ Enterobacteriaceae กรณีใช้ตาม
ข้อก�ำหนดของ CLSI ฉบับ M100-S21 ปี 2011 รายงานผลตามที่ได้จริง ควรทดสอบและรายงาน
การสรา้ ง ESBL เพ่อื ประโยชน์ในการเฝา้ ระวังโรคติดเชื้อในโรงพยาบาล
6-2. Enterobacter spp., Citrobacter spp. และ Serratia spp. อาจเปลี่ยนจากไวต่อยา 3rd generation
cephalosporins เป็นดื้อภายใน 3 หรือ 4 วัน หลังการรักษาดังนั้นจึงควรท�ำการทดสอบความไว
ของเช้อื กลุ่มนต้ี ่อยาดงั กลา่ วซ้ำ�
6-3. ควรทดสอบความไวของเช้ือกลุ่ม Enterobacteriaceae ต่อยา ertapenem, imipenem และ meropenem
พร้อมกนั เสมอเพือ่ เฝ้าระวงั เชือ้ ด้ือยากลุ่ม carbapenem resistance Enterobacteriaceae (CRE)
7. ห้ามทดสอบความไวของเชื้อ Shigella spp. และ Salmonella spp. ต่อยากลุ่ม 1st และ 2nd
cephalosporins, cephamycins และ aminoglycosides เน่ืองจากผลการทดสอบไม่สอดคล้องกับ
ผลการรกั ษา
8-1. ทดสอบ nalidixic acid เฉพาะตอ่ เชอ้ื Salmonella spp. ทแ่ี ยกได้จากตวั อยา่ งนอกล�ำไส้ (extraintestinal
Salmonella) เท่าน้ันหากพบว่าด้ือยา nalidixic acid แต่ไวต่อยากลุ่ม fluoroquinolone ต้องรายงานว่า
“Extraintestinal isolates of Salmonella may not be eradicated by fluoroquinolone treatment”
8-2. ทดสอบความไวและรายงานผล 3rd generation cephalosporins เฉพาะ Salmonella spp. ที่พบ
นอกล�ำไส้ เท่านั้น
9. เน่ืองจาก CLSI มิได้ก�ำหนด interpretation break point ส�ำหรับยา cefoperazone-sulbactam
ต่อ Pseudomonas aeruginosa และ Acinetobacter spp. จึงให้ใช้ break point ของยาดังกล่าวส�ำหรับ
เชอื้ Enterobacteriaceae
10. การหา MIC of colistin ส�ำหรับ Acinetobacter spp. ควรทดสอบด้วยวิธี agar หรือ broth dilution
การทดสอบดว้ ยวธิ ี E-test อาจใหผ้ ลท่ีไม่สอดคล้องกบั การรักษา
11-1. Haemophilus spp. ต้องใช้ Haemophilus test medium (HTM) ในการทดสอบความไวของเช้ือต่อยา
11-2. การทดสอบ β-lactamase เป็นวิธีท่ีรวดเร็วและถูกต้องส�ำหรับการตรวจหา TEM-type β-lactamase
ของเชื้อ Haemophilus spp. เม่ือพบว่า β-lactamase บวกให้รายงานดื้อ ampicillin และ amoxicillin
(พบ H. influenzae ทไี่ มส่ รา้ ง β-lactamase แตด่ อ้ื ampicillin จำ� นวนนอ้ ยมาก)
12. ทดสอบ nalidixic acid ต่อ N. meningitidis เพื่อบ่งช้ีว่าเช้ือมีความไวต่อ fluoroquinolone ลดลงหาก
พบว่า inhibition zone ≤ 25 mm
หมายเหตุ เช้ือแกรมลบรูปแท่งกลุ่ม non-fermentative ตัวอื่นๆ ท่ีไม่ใช่ Acinetobacter spp., P. aeruginosa,
S. maltophilia และ B. cepacia ต้องใช้วิธี MIC เท่าน้ัน เน่ืองจากไม่มีค่าแปลผลการทดสอบโดยวิธี
disk diffusion

คู่มือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารต้านจลุ ชพี 247

1.2.3 แผน่ สารต้านจลุ ชพี

ภาชนะที่บรรจุหลอดแผ่นยาต้องเป็นภาชนะที่มีฝาปิดสนิทกันความชื้นได้ และมีสารดูด

ความช้ืน ตรวจสอบคุณสมบัติสารดูดความช้ืนและควรเปลี่ยนใหม่เม่ือสีเปลี่ยน เก็บในตู้เย็นที่อุณหภูมิ

4-8 OC เก็บแผ่นยาที่เป็น stock ในตู้แช่แข็ง -14 OC หรือต่�ำกว่า ส�ำหรับแผ่นยาในกลุ่ม β-lactam ให้ใส่ใน

ภาชนะท่ีปิดผนึกและเก็บไว้ในตู้แช่แข็งโดยแบ่งจ�ำนวนน้อยเก็บในตู้เย็นส�ำหรับใช้ได้ไม่เกิน 1 สัปดาห ์

ยาอื่นที่ไม่คงตัว (เช่น imipenem, cefaclor และยาท่ีมี clavulanic acid ผสมด้วย) จะต้องเก็บในตู้เย็นแช่แข็ง

จนกวา่ จะน�ำมาใช้ และแผ่นยาท่ีใชท้ ดสอบต้องเปน็ แผน่ ยาท่ยี ังไม่หมดอายุเทา่ นนั้

ก่อนท�ำการทดสอบควรน�ำภาชนะท่ีบรรจุแผ่นยาออกจากตู้เย็นหรือตู้แช่แข็ง วางท่ี

อุณหภูมิห้องนาน 1-2 ชม. ก่อนเปิดใช้งาน เพื่อปรับอุณหภูมิภายในภาชนะให้เท่ากับอุณหภูมิห้องก่อนเปิด

เปน็ การป้องกนั ความช้นื ท่จี ะเกดิ จากการควบแนน่ เม่ืออากาศอ่นุ กระทบแผน่ ยาเย็นทอ่ี ยู่ในภาชนะ

1.2.4 อาหารเพาะเชอื้

การเตรยี ม Mueller-Hinton agar (MHA) ดูรายละเอยี ดทภี่ าคผนวก ส�ำหรับเชอื้ ชนิด aerobic

และ facultative anaerobic ท่ไี ม่สามารถเจริญเตบิ โตดีบน MHA ได้แก่ Haemophilus spp., Neisseria

gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, viridans streptococci และ β-hemolytic streptococci ต้องการ

supplement หรืออาหารเลีย้ งเชอื้ ชนิดอ่ืน และจะต้องใชว้ ธิ ีการทดสอบดังตารางท่ี 6-3 6บทท่ี

1.2.5 การเตรยี มเชอื้ ใหไ้ ดค้ วามขุ่นมาตรฐาน
การเตรียมเชื้อทดสอบมี 2 วธิ คี อื วิธเี ตรยี มเชอื้ จากการเพาะ (growth method) และวิธีเตรียม
เช้ือจากโคโลนีโดยตรง (direct colony suspension method)

1.2.5.1 วิธีเตรียมเช้ือจากการเพาะ (growth method) วิธีนี้เป็นทางเลือกอีกวิธีหน่ึง ส�ำหรับ

เช้ือเจริญง่าย (ยกเว้น staphylococci) โดยเฉพาะในกรณีท่ีเช้ือท่ีต้องการทดสอบมีอายุมากเกินไป (>24 ชม.)

นอกจากน้นั เป็นวธิ ีทีเ่ หมาะสำ� หรบั เชอ้ื ทลี่ ะลายในอาหารเหลวแลว้ ได้ความขนุ่ ไม่สม่ำ� เสมอ

(1) เขย่ี สว่ นบนของโคโลนีเด่ยี ว ที่มลี ักษณะเหมอื นกนั 3-5 โคโลนี ละลายในอาหารเลี้ยง

เชอื้ เหลว เช่น TSB 4-5 ml

(2) อบท่ี 35 ± 2 OC 2-6 ชม. ปรับความข่นุ ใหเ้ ท่ากับความขุ่นมาตรฐาน 0.5 McFarland

(1-2 x 108 CFU/ml) โดยใช้น�้ำเกลือที่ปราศจากเช้ือ หรืออาหารเลี้ยงเชื้อเหลว

วัดความขุ่นด้วยเครื่องมือวัดแสง หรือดูด้วยตาในท่ีที่มีแสงสว่างเพียงพอ โดยมี

แผน่ กระดาษซง่ึ มพี นื้ เป็นสีขาวและมีเส้นสดี ำ� วางไวด้ า้ นหลัง

1.2.5.2 วิธเี ตรียมเช้ือจากโคโลนโี ดยตรง (direct colony suspension method) เป็นวธิ ที สี่ ะดวก

ใช้ได้กับเชื้อเกือบทุกชนิด เป็นวิธีที่แนะน�ำส�ำหรับเชื้อเจริญยากได้แก่ Haemophilus spp., N. gonorrhoeae,

N. meningitidis และ streptococci รวมท้ัง staphylococci ทด่ี ื้อ methicillin หรือ oxacillin

คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

248 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารตา้ นจลุ ชพี

(1) เขีย่ สว่ นบนของโคโลนีเดยี่ วอายุ 18-24 ชม.ใสใ่ นน�้ำเกลอื หรืออาหารเลีย้ งเชื้อเหลว
(2) ปรับความขุ่นให้เท่ากับความขุ่นมาตรฐาน 0.5 McFarland (1-2 x 108 CFU/ml)
โดยใชน้ ำ้� เกลอื ทปี่ ราศจากเชอ้ื หรอื อาหารเลย้ี งเชอื้ เหลว วดั ความขนุ่ ดว้ ยเครอ่ื งมอื วดั แสง
หรือดูด้วยตาในที่ท่ีมีแสงสว่างเพียงพอ โดยมีแผ่นกระดาษซึ่งมีพื้นเป็นสีขาว และมี
เสน้ สดี ำ� วางไวด้ ้านหลงั
1.2.6 ขัน้ ตอนการทดสอบความไวของเช้อื ชนดิ เจริญไวตอ่ ยาโดยวธิ ี Disk diffusion Test
1.2.6.1 การเพาะเชือ้ ลงบนจานทดสอบ
(1) ภายใน 15 นาที ใช้ไม้พันส�ำลีปราศจากเช้ือจุ่มเชื้อที่ปรับความขุ่นแล้ว กดด้านข้างของ
หลอดเหนอื ระดบั น้�ำให้หมาดๆ
(2) ป้ายเช้ือลงบน MHA ท่ผี ิวหนา้ แห้งแล้ว 3 ระนาบ โดยหมนุ จานไป 60 องศา ข้ันสุดท้าย
ให้วนไมพ้ นั สำ� ลรี อบขอบวุ้น
(3) อาจเปิดฝาจานไวไ้ ด้ 3-5 นาที แตไ่ ม่เกนิ 15 นาที เพื่อลดความช้ืนที่มมี ากเกนิ ไป
1.2.6.2 การวางแผน่ ยาลงบนจานทป่ี า้ ยเชื้อแลว้
(1) วางแผน่ ยาลงบนอาหารหลงั ปา้ ยเชอ้ื ไมเ่ กนิ 15นาทีควรใหจ้ ดุ กลางของแผน่ ยาแตล่ ะแผน่
อยู่ห่างกันอย่างน้อย 24 mm กดแผ่นยาให้แนบกับผิวหน้า วางแผ่นยาไม่เกิน 12 แผ่น
บนจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 150 mm หรือไม่เกิน 5 แผ่นบนจานขนาด 100 mm
ห้ามย้ายที่แผ่นยาหลังวางลงบนอาหารแล้วเนื่องจากยากระจายลงในอาหารได้ทันที
ไมค่ วรวางแผน่ ยาใกลข้ อบจานอาหารจนเกนิ ไปเพราะinhibitionzoneของยาจะไมค่ รบวง
(2) หลังจากวางแผน่ ยา นำ� ไปใสใ่ นตอู้ บเชื้ออุณหภมู ิ 35 ± 2 OC ภายใน 15 นาที (ทอี่ ุณหภูมิ
มากกวา่ 35 °C จะไม่สามารถตรวจหา MRSA ได)้ กรณเี ช้ือเจรญิ ยากอบในบรรยากาศ
CO2
1.2.6.3 การอา่ นและการแปลผล
(1) อ่านผลหลังจากอบเช้ือ 16-18 ชม. ส�ำหรับเช้ือเจริญไว ยกเว้น Burkholderia cepacia,
Acinetobacter spp. และ Stenotrophomonas maltophilia ต้องอบ 20-24 ชม. ส�ำหรับ
เช้ือเจริญยากต้องอบให้ครบ 24 ชม. ยกเว้น Haemophilus spp. อบเช้อื 16-18 ชม. ให้วดั
เสน้ ผ่านศนู ย์กลางของ zone ทมี่ ีการยับย้งั เชอ้ื อยา่ งสมบูรณ์ (โดยดูด้วยตาเปล่า)
(2) การวัด zone ให้วัดเป็น mm โดยใช้ calipers หรือไม้บรรทัดวางบนด้านหลังของจาน
ทดสอบ โดยถือจานในระยะเหนอื พน้ื 2-3 นิ้ว นอกจากน้ีมีขอ้ ยกเว้นดงั นี้

ค่มู ือการปฏิบัติงานแบคทีเรยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารตา้ นจลุ ชีพ 249

- อาหารเล้ียงเช้ือท่ีผสมเลือด ให้เปิดฝาจานทดสอบไว้และวัด zone จากด้านบนของ 6บทท่ี
อาหารโดยมแี สงสอ่ งด้านหนา้ (reflected light)
- การตรวจหา methicillin resistance ของเช้ือ Staphylococcus spp. ให้อบเช้ือไว้
นาน 24 ชม.
- การตรวจหา vancomycin ของเชอ้ื Enterococcus spp. ให้อบเชือ้ ไว้นาน 24 ชม.
- ถ้าใช้แผน่ ยา linezolid ทดสอบเช้ือ Staphylococcus spp. ใหอ้ ่าน inhibition zone ดว้ ย
ไฟส่องหลงั จาน (transmitted light)
(3) ขอบของ zone จะก�ำหนดจากบริเวณที่ไม่มีเชื้อโดยดูด้วยตาเปล่า ถ้าใช้แว่นขยายเห็นมี
เชอ้ื ข้นึ เปน็ โคโลนีเล็กทรี่ ิม zone ถือวา่ ไมม่ เี ช้ือ อยา่ งไรก็ตาม
- ถ้ามีโคโลนีเกิดขึ้นอย่างชัดเจนใน inhibition zone ควรท�ำการทดสอบใหม่ ถ้ายังมี
โคโลนีขึ้นอย่างชัดเจนใน zone อีก ให้วัดความกว้างของ zone ด้านในตรงบริเวณ
ทไี่ มม่ เี ช้ือขึ้น
- เชื้อในกลุ่ม Proteus spp. อาจจะแผ่ปกคลุมบริเวณท่ีเชื้อถูกยับย้ังรอบแผ่นยา ให้วัด
inhibition zone ทเ่ี ห็นขอบชดั โดยไม่สนใจเชื้อทีแ่ ผ่บาง ๆ (swarm) ภายใน inhibition
zone
- ในการทดสอบเชอ้ื streptococci ทใ่ี ห้ hemolysis ให้วัด zone ตรงที่เช้ือเริม่ ไมข่ ึน้ ไม่ใช่
zone ทม่ี ีการแตกของเมด็ เลือดแดง
- ในการทดสอบ trimethoprim และ sulfonamides ให้วัด inhibition zone ท่ีเห็นขอบ
คอ่ นขา้ งชดั โดยไมส่ นใจเชอ้ื ทขี่ ึ้นเลก็ น้อย (≤ 20%) ภายใน inhibition zone
(4) การแปลผลความกว้างของ zone ยับยงั้ เชื้อให้ ดใู นตารางที่ 2A ถึง ตารางที่ 2I ใน CLSI
M100-S24 ใหร้ ายงานเปน็ S (susceptible), I (intermedite) หรอื R (resistant) ตอ่ ยาทใ่ี ช้
ทดสอบ ยาบางชนิดรายงานไดเ้ พยี ง susceptible หรอื nonsusceptible เนื่องจากมีขอ้ มลู
คา่ breakpoint เฉพาะ susceptible เทา่ นนั้ เพราะยงั ไมม่ กี ารดอ้ื ยามากอ่ นหรอื มเี ชอ้ื ทด่ี อ้ื ยา
นอ้ ยมาก ในการบนั ทกึ ผลการทดสอบควรบนั ทกึ ขนาดinhibitionzoneดว้ ยเพอื่ เปน็ ขอ้ มลู
ใชว้ เิ คราะหแ์ นวโนม้ การด้ือยา

คูม่ ือการปฏิบัตงิ านแบคทีเรียและรา

250 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารตา้ นจลุ ชพี

ตารางที่ 6-2 สรปุ ย่อการทดสอบความไวของเชอ้ื ชนดิ เจรญิ ไวต่อสารตา้ นจุลชพี โดยวธิ ี disk diffusion test

Organism Medium 0.5 McFarland Incubation Incubation Comments/Modifications
Inoculum Time

Enterobacteriaceae MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 16 - 18 ชม. ESBL production,
หรือ saline, ambient air Carbapenemase production
GM: TSB, 2-6 ชม

Pseudomonas MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 16 - 18 ชม.
aeruginosa หรอื saline, ambient air
GM: TSB, 2-6 ชม.

Acinetobacter spp. MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม.
หรือ saline, ambient air
GM: TSB, 2-6 ชม.

Burkholderia cepacia MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม.
หรอื saline, ambient air
GM: TSB, 2-6 ชม.

Stenotrophomonas MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม.
maltophilia หรือ saline, ambient air
GM: TSB, 2-6 ชม.

Staphylococcus spp. MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 16 – 18 ชม.; β-lactamase test,
หรือใน saline ambient air 24 ชม.สำ� หรบั D-test (inducible clindamycin
(การทดสอบ S. aureus ตอ่ ยา resistance)
ที่อุณหภมู ิ oxacillin;
> 35 °C 24 ชม. ส�ำหรบั Examine oxacillin, vancomy-
อาจตรวจไมพ่ บ staphylococci cin, and linezolid zones
MRSA) ทกุ species carefully with transmitted
ต่อยา vancomycin; light for small colonies or
24 ชม. ส�ำหรับ haze inside the zone of
coagulase- inhibition; any growth
negative = resistance. Vancomycin
staphylococci disk diffusion testing is not
ตอ่ ยา cefoxitin recommended for coagulase-
negative staphylococci.

Aeromonas spp. MHA DCS ใน MHB 35 °C 16-18 ชม.
& หรอื saline จากเช้ือ
Plesiomonas ทีข่ ึ้นบน
nonselective
shigelloides medium eg. BA
นาน 18-24 ชม.

Moraxella catarrhalis MHA DCS 5% CO2 20-24 ชม. β-lactamase test

Pasteurella spp. MHA DCS 16-18 ชม.
*DCS = direct colony suspension ใน MHB หรอื saline จากเชอ้ื ท่ีขึ้นบน nonselective medium eg. BA,
GM = growth method, MRS = methicillin-resistant staphylococci.

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจุลชพี 251

ตารางที่ 6-3 สรปุ ย่อการทดสอบความไวของเชอื้ fastidious แบคทีเรีย ต่อสารต้านจุลชีพโดยวธิ ี
disk diffusion test

Organism Medium 0.5 McFarland Incubation Incubation Comments/Modifications
Enterococcus spp. Inoculum Time Examine vancomycin zones
carefully with transmitted
MHA Direct colony 35 ± 2 °C; 16-18 ชม. ; light for small colonies or
suspension ใน ambient air 24 ชม. ส�ำหรับ haze inside the zone of
MHB หรอื ใน vancomycin inhibition;
saline, หรอื วธิ ี any growth= resistance.
growth method β-lactamase test,
Test a maximum of
Haemophilus Direct colony 35 ± 2 °C; 16-18 ชม. 9 disks on a 150 mm plate and
influenzae, suspension ใน 5% CO2 4 disks on a 100 mm plate
MHB หรอื ใน
Haemophilus saline (โดยใช้ Test a maximum of
parainfluenzae เชอ้ื ทอ่ี บนาน 9 disks on a 150 mm plate and
20-24 ชม. บน CA) 4 disks on a 100 mm plate
For some agents, eg,
Neisseria gonorrhoeae GC agar Direct colony 36 ± 1 °C 20-24 ชม. fluoroquinolones or
base suspension ใน (หา้ มเกนิ 37 °C); cephalosporins, only 2 to 3
with 1% MHB or 0.9% 5% CO2 disks may be tested per plate.
defined phosphate
supplement buffered saline, Test a maximum of
pH 7.0, (โดยใช้ 9 disks on a 150 mm late and 6บทท่ี
เชอ้ื ที่อบไวน้ าน 4 disks on a 100 mm plate.
20-24 ชม. บน CA Measure the zone of growth
อบท่ี 5% CO2) inhibition, not the zone of
inhibition of hemolysis.
Streptococcus MHA with Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม. D-test (β-streptococci)
pneumoniae BA suspension ใน 5% CO2 Test a maximum of
MHB หรอื ใน 9 disks on a 150 mm plate and
saline (โดยใช้ 4 disks on a 100 mm plate
เชือ้ ท่ีอบไวน้ าน
18-20 ชม. บน BA)

Streptococcus spp. MHA with Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม.
BA suspension ใน 5% CO2

MHB หรอื ใน
saline

Measure the zone of growth
inhibition, not the zone of
inhibition of hemolysis.

คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

252 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี

Organism Medium 0.5 McFarland Incubation Incubation Comments/Modifications
Neisseria MHA with Inoculum 35 ± 2 °C; Time Test a maximum of
BA 5% CO2 5 disks on a 150 mm plate and
meningitidis Direct colony 20-24 ชม. 2 disks on a 100 mm plate
BMHA suspension ใน 36-37 °C Caution: Perform all testing
Campylobacter MHB หรือใน or 42 °C 48 ชม. in a BSC.
jejuni/ coli saline (โดยใช้ 10% CO2, 24 ชม.
เชอ้ื ทอี่ บไว้นาน 5% O2,
20-24 ชม. 85% N2
CA plate อบท่ี
5% CO2)
DCS

1.3 การควบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเชื้อตอ่ สารต้านจลุ ชพี
จุดมุ่งหมายของการควบคุมคุณภาพคือเพ่ือติดตามความแม่นย�ำถูกต้องของวิธีการ น้�ำยาทดสอบ
อาหารเล้ียงเช้ือ แผ่นยาและสมรรถนะของผู้ปฎิบัติการทดสอบ อ่าน และแปลผล ดังนั้นวิธีท่ีดีที่สุด
ในการควบคุมคุณภาพคือ การเลือกใช้เช้ือมาตรฐานอ้างอิงเพื่อน�ำมาทดสอบตามวิธีท่ีด�ำเนินการอยู่และ
ตรวจสอบผลว่าตรงตามท่ีควรจะเปน็ หรอื ไม่
1.3.1 การควบคุมคุณภาพภายในส�ำหรบั เช้อื กอ่ โรคที่เจริญเรว็ (rapid-growing aerobic pathogens)
หอ้ งปฎบิ ตั กิ ารทกุ แหง่ ทที่ ำ� การทดสอบความไวของยาตอ่ เชอื้ เจรญิ งา่ ย(nonfastidiousbacteria)
อย่างนอ้ ยต้องมีเชอื้ มาตรฐาน 6 เช้อื (จากแหล่งทเ่ี ช่ือถือและสามารถสอบกลบั ได)้ ส�ำหรับควบคณุ ภาพ ดังนี้
E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC
49619, E. coli ATCC 35218 (ส�ำหรับควบคุมคุณภาพการทดสอบด้วยแผ่นยา β-lactamase inhibitor
combinations containing clavulanic acid, sulbactam, or tazobactam) และ Enterococcus faecalis ATCC 29212
(สำ� หรบั ควบคมุ การทดสอบการใชแ้ ผน่ ยา trimethoprim หรอื sulfonamides a high concentration of gentamicin
หรือ streptomycin (ดูรายชื่อเช้ืออื่นๆที่ทดสอบและเช้ืออ้างอิงท่ีใช้ควบคุมคุณภาพจากตารางที่ 6-4 และ 6-5
และดคู ณุ ลักษณะของเช้ือมาตรฐานจากตารางท่ี 6-6)
เช้ือส�ำหรับควบคุมคุณภาพจะต้องได้รับการทดสอบโดยวิธีมาตรฐานการทดสอบกับแผ่นยา
โดยในอาหารทดสอบและวธิ กี ารเช่นเดยี วกบั เช้ือท่แี ยกไดจ้ ากผปู้ ่วย
คา่ ควบคมุ ตำ่� สดุ และสงู สดุ ทค่ี วรจะเปน็ ในการควบคมุ คณุ ภาพ มกี ำ� หนดอยใู่ นเอกสารอา้ งองิ
ของ CLSI หากผลการควบคุมคุณภาพของห้องปฏิบัติการ ผิดพลาดจากค่าควบคุม 1 คร้ัง ใน 20 ครั้ง ถือว่า
ยอมรับได้ แต่ถา้ ความผดิ พลาดมีมากกวา่ น้จี ะต้องหาสาเหตุและทำ� การแกไ้ ขทนั ที

คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

ตารางท่ี 6-4 เชอ้ื ที่ทดสอบและเชอื้ อา้ งอิงท่ใี ชค้ วบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเชือ้ ตอ่ สารตา้ นจลุ ชีพ โดยวธิ ี disk diffusion test (M100-S23)

เชอ้ื อ้างองิ ทีใ่ ช้ E. coli E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa S. aureus S. aureus E. faecalis H. influenzae H. influenzae N. gonorrhoeae S. pneumoniae
ควบคุมคณุ ภาพ ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 29212 ATCC 49247 ATCC 49766 ATCC 49226 ATCC 49619
เช้อื ทท่ี ดสอบความไว ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 700603 ATCC 27853
difd✓fuisskion dmile✓uthtioodn dmile✓uthtioodn ✓ ✓ ✓
Enterobacteriaceae ✓ ✓* ✓ difd✓fuisskion ✓
✓* ✓ ✓
Pseudomonas aeruginosa ✓ ✓* ✓ ✓
✓* ✓ ✓
Acinetobacter spp. ✓ ✓* ✓
✓* ✓
Stenotrophomonas maltophilia ✓

Burkholderia cepacia ✓

Other non-Enterobactericeae ✓

Staphylococcus spp. ✓*

Enterococcus spp. บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจลุ ชีพ 253

HHeaaemmoopphhiilluuss ipnafrlauiennflzuaeenaznade6บทท่ี ✓**

Neisseria gonorrhoeaeคมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รียและรา

Neisseria meningitidis ✓

Streptococcus pneumoniae

Sβ-trheepmtoocloycticcugsrosuppp.

Svitrriedpatnoscogcrcouuspspp.

* For β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations
** When testing amoxicillin-clavulanic acid

254 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจุลชพี
ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา
ตารางที่ 6-5 เช้ือที่ทดสอบและเช้อื อ้างองิ ทใี่ ช้ควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเชือ้ ตอ่ สารตา้ นจลุ ชีพ (M45-A2)

เชอ้ื ท่ีทดสอบความไว เชอ้ื อ้างองิ ที่ใช้ E. coli E. coli P. aeruginosa S. aureus S. aureus S. pneumoniae C. jejuni H. pylori
ควบคมุ คณุ ภาพ ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 49619 ATCC 33560 ATCC 43504

Abiotrophia spp. and Granulicatella spp. ✓ ✓** difd✓fuisskion dmile✓uthtioodn ✓

Aeromonas spp. and Plesiomonas shigeloides ✓ ✓**
Bacillus spp. (not B. anthracis)
✓
Campylobacter jejuni / coli micmroe✓dthiloudtion

C o riynncleubdaicntgerCiu.mdispphpth. eriae gent✓faomr icin ✓
Erysipelothrix rhusiopathiae
HACEK group**** gent✓faomr icin ✓
Helicobacter pylori gent✓faomr icin ✓

Lactobacillus spp. ✓

Leuconostoc spp. ✓
✓
Listeria monocytogenes

เช้ือท่ที ดสอบความไว เชื้ออ้างอิงที่ใช้ E. coli E. coli P. aeruginosa S. aureus S. aureus S. pneumoniae C. jejuni H. pylori
ควบคุมคุณภาพ ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 49619 ATCC 33560 ATCC 43504

Moraxella catarrhalis ✓** difd✓fuisskion dmile✓uthtioodn

Pasteurella spp. ✓ ✓
✓** difdfuisskion

Pediococcus spp. gent✓faomr icin ✓

Vibrio spp. (including V. cholerae) ✓ ✓**

Burkholderia pseudomallei ✓ ✓** ✓

Burkholderia mallei บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจลุ ชีพ 255✓✓

Francisella tularensis6บทท่ี

คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รียและรา
✓✓ ✓

Bacillus anthracis ✓ ✓

Brucella spp. ✓ ✓

Yersinia pestis ✓

* disk diffusion (amoxicillin-clavulinic acid and doxycycline)
** for β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations
*** when testing amoxicillin-clavulanic acid
**** HACEK group = Aggregatibacter spp. formerly Haemophilus aphrophilus, H. paraphrophilus, H. segnis, Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Cardiobacterium spp., Eikenella corrodens and Kingella spp.

256 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจุลชพี
ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา
ตารางท่ี 6-6 คณุ ลักษณะของเชือ้ มาตรฐานสำ� หรบั ใชใ้ นการควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเชื้อแบคทเี รียต่อสารตา้ นจลุ ชีพ

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Testscs MIC Tests Screening Tests Other
ABaTcCteCro2id5e2s85fragilis β-lactamase positive All anaerobes
ABaTcCteCro2id9e1s48thetaiotaomicron
AClToCstCrid7i0u0m05d7ifficile β-lactamase positive All anaerobes
AEnTtCerCoc2o9c2c1u2s faecalis
β-lactamase negative aGnrtaimmi-cproosbitiiavleagents
AEnTtCerCocao5c1c2u9s9faecalis Ngroanmf-apsotisdiitoivues bacteria
AEsTcCheCri2c5h9ia2c2oli Rhiegshis-lteanvtetloavmainncoogmlyyccoinsi(dVesanB) and H HV iLa rmgneAhscu-iRopslmet ia rvnyoecccleiinnMagICartest A A b Mss c mrtssoroeeuinetmssehtdssleeilmnssuetuuhtrmi-iiociHttnrpaafoiobbrendiriiamtlliociislttuhnuyyMtlfibfooooIoaffCrnntcd.cathaametp/silitootdosnte.mooyfrc i n
NN o. gmnrfaeamnsti-inndgeiiogtuiadstiivse bacteria HVaLnAcRomycin agar
AEsTcCheCri3c5h2ia1c8oli βin-hlaibctiatomr/cβo-mlacbtianmataiosens
EAuTbCaCcte4r3iu0m55lentum β-Lactamase negative NN eo binsafscaetsertiriaidaimouensignrgaimtid-nisegative All anaerobes
HAaTeCmCop4h9i2l4u7s influenzae
HATaeCmCop4h9i2l4u7s influenzae Cβ-olanctatainmsapsleas(nmoind--EenScBoLd)ead, b,Te,Ef M-1 βin-hlaibctiatomr/cβo-mlacbtianmataiosens

BLNAR Haemophilus spp. Haemophilus spp.

Ampicillin susceptible β(Hm-aloaecrmetaormpehpsi)rloudsuscpibpl.e with selected βrHe-aplaercomtdaoumpchsibi)llueswspitph.(smeloerceted

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Testscs MIC Tests Screening Tests Other
AKTleCbsCie7ll0a0p6n0e3umoniae Contains SHV-18 ESBL cEoSnBfiLrmscartoeeryn taensdts EcoSnBfiLrmscartoeeryn taensdts
NATeiCssCer4ia92g2o6norrhoeae N. gonorrhoeae N. gonorrhoeae AcMMosIunsCeteelsalnsentrsdi-unHditeiiansabkctiohldnitibyfaffouotcrsfhicog/laneotn.itotoanfmicin
PAsTeCudCom27o8n5a3s aeruginosa CMRNG Ngroanmf-ansetigdaiotiuvse bacteria
SAtTapChCyl2o5c9o2c3cus aureus Ngroanmf-ansetigdaiotiuvse bacteria
Cβ-olanctatainmsaisneducible AmpC Ngroanmf-ansetigdaiotiuvse bacteria
SAtTapChCyl2o9c2o1c3cus aureus
β L -i LtmmttolaeeocecstvxaAtatmdrlenuramueesggeeisanntsiMeuvgseIcaCetipvtteeisbtiilnitgydtoue gNroanmf-ansetigdaiotiuvse bacteria Cefoxitin MIC testing I H n i ( d dcrrmdgDieuelihfisfsuzcfn-fiiuopilssudbesnittsalrviaaeeioomnenonctlccnyeieentscteteidd)snsiitsst kk
SAtTapChCyl4o3c3o0c0cus aureus
SAtTapChCylBocAoAcc-1u7s0a8ureus บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจลุ ชีพ 257m W eescatArkainβne-lgaacttiavme ase–producingSSN.t.rpemnpeetonucimnogocicntuiidaseisspp.IHO n ix dmcrrgaeeulhcssiucn-iiiipsslldbettliaaiarlvnnneomecccaleey ig ncMMairnIICCtestAMMcosIunsCeteelsalnsentrsdi-unHditeiiansabkctiohldnitibyfaffouotcrsfhicog/laneotn.itotoanfmicin
AStTreCpCtoc4o9c6c1u9s pneumoniae test
6บทท่ี
OmxeaccAillpino-srietsivisetant, Cteesftionxgitin disk diffusion Oxacillin agar
คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รียและราHrmeisugipshAt-alnegvceeenlmemeudpiairteodcibny the NSSt..rpemnpeetonucimnogocicntuiidaseisspp.
Paplretoentrieecidinllpineninictielrlminebdiinadteinbgy Hmreisugipshit-ralonecvcieenltest
crInelisdniusdctaaimbnlcyeeciMnIC test

258 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจุลชพีQuality Control StrainOrganism CharacteristicDisk Diffusion TestscsMIC TestsScreening TestsOther
ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและราSupplemental QC Strains
EAnTtCerCoc3o3c1c8u6s faecalis AEssMsAAuaunlTTmIlitdtfCeCCaoerpbnCCnaaoiaanlsi22imtdntif99yvtoids22deroi11easftE22rkoome..trdEfoteaith.fdreaefificsmuausaesmeelicisotashsfnlooistprersitms.d
gArsoswesths ecaacphabbialittcihe/slootffHorTM.
HAaTeCmCop1h0i2l1u1s influenzae
AKTleCbsCieBllAa pAn-e1u7m05oniae MKPHCT-pproosdiuticvieng strain tpPerhsoetdnfuoocrttycipoainrcb(caMopneHnfiTermm) aatsoery
KATleCbsCieBllAa pAn-e1u7m06oniae M R ebcHsayiTrsbmtaanenpecteghntaaoetnimvciaseamrsbesapoethneermtshan Ppterhsoetdnfuoocrtytcipoainrcb(caMopneHnfiTermm) aatsoery

Supplemental QC Strainsg WmeaekcA-lancetagmataivsee producing strain Pzoenneic-eildligne test
AStTapChCy®loc2o9c2c1u3s aureus
SAtTapChCylBocAoAcc-9u7s6aureus C o mntaacirnoslimdesr-Aon-lmyerdeisaistetadnce ttAceilvissnetss)desawsmidtyhicsekinrya(tpDhpr-rozomoxniymecitanetsiaotnnndega-

AStTapChCylBocAoAcc-9u7s7aureus C monetdaiiantseidnrdeuscisibtalenceermA tApceloissnstssidetisawvsmeidt)yhicsekinrya(tpDhpr-rozomoxniymecitanetsiaotnnd

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี 259

การเกบ็ และการใชเ้ ช้ือส�ำหรับควบคุมคณุ ภาพ 6บทท่ี

- เช้ือที่จะเก็บไว้เป็นเวลานาน (stock culture) ควรเก็บเช้ือที่อุณหภูมิ -20 OC หรือต่�ำกว่า โดยใส่ใน
อาหารเหลว ทม่ี ี stabilizer ทเ่ี หมาะสม เชน่ TSB ทใี่ ส่ 50% fetal calf serum หรอื ใส่ 10-15 % glycerol
อาจใช้ skim milk หรอื defibrinated blood แทน TSB ได้ เกบ็ ในรูปแบบ freeze-dried โดยไมม่ คี วาม
เสีย่ งต่อการเปลย่ี นแปลงความไวต่อสารตา้ นจุลชีพ
- เชอ้ื สำ� หรบั ควบคมุ คณุ ภาพทใี่ ชง้ าน (working culture) ควรเกบ็ บน TSA slant (สำ� หรบั เชอื้ เจรญิ งา่ ย)
หรือบน enriched CA slant / BA slant (สำ� หรบั เช้ือเจรญิ ยาก) ทอี่ ณุ หภมู ิ 2 – 8 OC และน�ำมาเพาะ
ใหม่ทกุ สัปดาหเ์ ป็นเวลาไม่เกิน 4 สัปดาห์ติดต่อกนั แล้วเตรียมเช้ือใหมจ่ าก stock culture
- ก่อนการทดสอบให้เพาะเช้ือบนจานอาหารเพื่อให้ได้โคโลนีเด่ียว ส�ำหรับ stock culture ควรน�ำมา
เพาะซำ้� 2 คร้งั กอ่ นน�ำไปทดสอบ
- น�ำเช้ือที่ใช้ในการควบคุณภาพไปท�ำการทดสอบตามขั้นตอน เช่นเดียวกับเช้ือตัวอย่างที่ต้องการ
ทดสอบความไวต่อสารต้านจลุ ชีพ
- ผลการทดสอบเช้ือควบคุมคุณภาพจะต้องอยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้ หากไม่อยู่ในเกณฑ์ อาจเพราะ
วิธกี ารทไ่ี ม่ถกู ตอ้ ง หรอื เช้อื มาตรฐานท่ใี ช้ทดสอบไม่ไดม้ าตรฐาน ควรเปลยี่ นเชอื้ มาตรฐานสำ� หรบั
ควบคุมคุณภาพใหม่
- เชอื้ E. coli ATCC 35218 และ K. pneumoniae ATCC 700603 ทใ่ี ชใ้ นการควบคมุ มาตรฐานของการ
ทดสอบ มีรายงานพบการสูญเสีย plasmid ส�ำหรับการควบคุม β-lactamase เม่ือมีการ subculture
หลายคร้งั ทำ� ใหผ้ ลการควบคุมคุณภาพอยูน่ อกขอบเขตที่ยอมรับได้

คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

260 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารต้านจลุ ชพี

การใช้เชื้อควบคุมคณุ ภาพ
1. นำ� เช้อื ท่เี กบ็ รักษาในตู้แชแ่ ขง็ หรอื เชือ้ ท่ี sub culture ใหมจ่ ากที่เกบ็ รกั ษา (stock culture) ไว้

2. Sub culture เชอ้ื บนอาหารเลีย้ งเชอื้ ท่ีเหมาะสมและอบใหเ้ ชอื้ เจรญิ (primary subculture)

3. Sub culture ในหลอดอาหาร (slant) หรอื จานอาหารเลย้ี งเชอื้ อบ และเกบ็ ในสภาวะทเี่ หมาะสมกบั ชนดิ เชอื้
และนำ� มา sub culture ใชใ้ นสปั ดาหท์ ห่ี นงึ่ ไดเ้ ปน็ เวลา 7 วนั จากวนั ที่ 1 ถงึ วนั ที่ 7 สำ� หรบั เปน็ working culture

4. ทกุ สัปดาห์ sub culture เช้ือจาก slant หรอื จานอาหาร working culture วันที่ 1 (ในขอ้ 3) เก็บในอณุ หภูม ิ
ทเี่ หมาะสมสำ� หรับใช้ในสปั ดาหท์ ่ี 2

5. ดำ� เนินการซำ้� ได้จนถึงสปั ดาหท์ ่ี 3 และ 4 หลังจากนั้นทงิ้ เชอื้ นี้ และนำ� เชื้อจาก stock ในข้อ 1 ดำ� เนินการ
ตามข้อ 2-5 ตอ่ ไป

คู่มอื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารต้านจุลชีพ 261

ค่ายอมรับของ zone ยับยั้ง

ผลการทดสอบความไวของเชื้อมาตรฐานท่ีใช้ควบคุมคุณภาพต่อยาแต่ละชนิด ต้องได้ค่าเส้นผ่าน
ศูนยก์ ลาง zone ยับย้ังอยใู่ นชว่ งทยี่ อมรับได้ ดังแสดงในตาราง CLSI: M100-S24

ความถี่ของการทดสอบเพื่อควบคุมคณุ ภาพ

ควบคุมคุณภาพทั้งระบบโดยใช้เชื้อมาตรฐานที่เหมาะสมทดสอบกับยาแต่ละชนิดทุกวัน 20-30 วัน
ตดิ ตอ่ กนั ผลการทดสอบผดิ พลาดไดไ้ มเ่ กนิ 1 ใน 20 หรอื 3 ใน 30 คร้ัง กรณีทผ่ี ลไม่อยู่ในเกณฑ์ตอ้ งหาสาเหตุ
และปฏิบัติการแก้ไขทันที และท�ำการทดสอบใหม่ต่อเนื่องกันเป็นเวลา 5 วัน เม่ือผลอยู่ในค่าท่ียอมรับได้
จึงเริ่มทำ� การทดสอบประจ�ำวนั ได้
การทดสอบความไวของเช้ือต่อยาที่เป็นงานบริการประจ�ำวัน ต้องท�ำการควบคุมคุณภาพอย่างน้อย
สัปดาห์ละ 1 ครง้ั กรณีหอ้ งปฏิบตั กิ ารท่ีท�ำการทดสอบไม่เป็นประจำ� จะต้องท�ำการควบคุมคุณภาพทกุ ครงั้

การแกไ้ ขขอ้ ผิดพลาด 6บทที่

ข้อผิดพลาดท่ีเปน็ สาเหตใุ หผ้ ลการทดสอบอย่นู อกเกณฑ์ยอมรบั ไดแ้ ก่
- เชื้อทใี่ ชส้ ำ� หรับควบคมุ คณุ ภาพ
- วัสดุและสารท่ีใช้
- ขบวนการทดสอบ
- เครื่องมอื

การรายงานผลของผปู้ ่วยในกรณีผลการควบคุมคุณภาพอยูน่ อกเกณฑ์ทย่ี อมรับ

ไม่รายงานผลการทดสอบ ตรวจสอบทบทวนรูปแบบความไวของเชื้อต่อยาของผู้ป่วยแต่ละคนที่เคย
ท�ำมาก่อน หรือทบทวน antibiogram ท่ีเคยรวบรวมไว้ และใช้วิธีการทดสอบอ่ืน หรือส่งต่อไปทดสอบที่
ห้องปฏิบตั ิการอ้างองิ จนกว่าปัญหาจะได้รับการแก้ไข

ขบวนการควบคมุ อน่ื ๆ

- การควบคมุ คุณภาพความเข้มขน้ ของเชอ้ื ทดสอบ
- ควบคมุ การอา่ นคา่ สำ� หรบั แปลผล

คมู่ ือการปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

262 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียตอ่ สารต้านจลุ ชีพ

ข้อจ�ำกัดของวธิ ที ดสอบความไวโดยใชแ้ ผ่นยา (Disk diffusion methods)
การศึกษาในขณะนีก้ ารทดสอบโดยวธิ ี Disk diffusion ยังไมเ่ พียงพอที่จะสร้างมาตรฐาน ทใ่ี ห้ผลถูกต้อง
แมน่ ยำ� สำ� หรบั การแปลผล เชอื้ บางชนดิ อาจตอ้ งทดสอบโดยวธิ หี าคา่ MIC (dilution method) ถา้ มคี วามจำ� เปน็
การใช้วธิ ี dilution method อาจเป็นวิธที ดสอบท่ีเหมาะสมท่ีสุด ซึง่ อาจตอ้ งส่งเชอื้ ไปยงั หอ้ งปฏบิ ัตกิ ารอา้ งอิง

ผลท่ที ำ� ให้เกดิ การเขา้ ใจผิด
ผลการทดสอบความไวของยาบางกลุ่มต่อเช้ือบางชนิด อาจรายงานว่ายาไวต่อเชื้อท้ังๆที่เชื้อนั้นดื้อยา
ทำ� ใหเ้ ข้าใจผดิ ซึ่งก่อใหเ้ กิดอันตรายต่อผู้ปว่ ย ไดแ้ กก่ ารทดสอบยาตอ่ เชอื้ ดังต่อไปนี้
- 1st และ 2nd -generation cephalosporins, cephamycins และ aminoglycosides ต่อเชื้อ
Samonella และ Shigella spp.
- Penicillins, β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations, cephems (ยกเว้น
cephalosporins with anti-MRSA activity), และ carbapenems ต่อเชื้อ oxacillin-resistant
Staphylococcus spp. (MRSA)
- Aminoglycosides (ยกเว้น high concentrations), cephalosporins, clindamycin และ
trimethoprim-sulfamethoxazole ตอ่ เชอ้ื Enterococcus spp.

ปรากฏการณด์ ื้อยาระหวา่ งการรกั ษาและการทดสอบซ้�ำ
เช้ือจุลชีพบางชนิดอาจกลายจากไวเป็นด้ือหรือดื้อปานกลาง เมื่อผู้ป่วยได้รับการรักษาด้วยยาเดิม
ภายใน 3 -4 วัน เช่น เช้อื Enterobacter spp., Citrobacter spp. และ Serratia spp. กบั ยากลมุ่ 3rd -generation
cepholosporins เชื้อ P. aeruginosa กับสารตา้ นจุลชพี ทุกชนิด และเชอื้ staphylococci กับ quinolones ส�ำหรับ
S. aureus ทไ่ี ว vancomycin อาจกลายเปน็ ดือ้ หลังใชร้ กั ษาผู้ปว่ ยเป็นระยะเวลานาน จงึ ตอ้ งทำ� การทดสอบความ
ไวของเชอ้ื ชนดิ เดียวกนั ซ�ำ้ ทุกครัง้ ทแี่ ยกไดใ้ นระหวา่ งการรักษา

การตรวจคัดกรองการดอ้ื ยา
ผลที่ได้จากการทดสอบคัดกรองบางวิธีน้ีอาจมีความไวและความจ�ำเพาะเพียงพอ สามารถออกผลและ
พจิ ารณารักษาผูป้ ว่ ยได้โดยไมต่ ้องทดสอบดว้ ยวธิ อี ่ืนอีก บางวธิ ีจะตอ้ งทดสอบดว้ ยวิธอี น่ื เพิม่ เพอ่ื ยนื ยนั

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารต้านจุลชีพ 263

ตารางท่ี 6-7 รายการตรวจคัดกรองการด้ือยาตามชนิดการด้ือยาที่แสดงออก (Phenotype) หรือตามกลไกการ
ดือ้ ยา

Resistance วิธีตรวจคัดกรอง การทดสอบยนื ยนั เพิ่ม
เช้อื Phenotype หรอื

กลไกการดือ้ ยา

Enterobacteriaceae ESBL production Broth microdilution และ disk diffusion ทำ� การทดสอบเพิม่ หากให้
ต่อยากลุ่ม cephalosporins และ ผลบวก
aztreonam

Carbapenemase Broth microdilution และ disk diffusion ท�ำการทดสอบเพ่มิ หากให้
production ต่อยากลุ่ม carbapenems ผลบวก

Staphylococcus β-lactamase Penicillin disk diffusion zone-edge test Yes, if screen test negative,
aureus production หรือวิธอี ่นื repeat penicillin MIC และ
β-lactamase test(s) (eg,
penicillin disk diffusion 6บทท่ี
zone-edge test or induced
β-lactamase test) on
subsequent isolates from
same patient (if penicillin
MIC ≤ 0.12 μg/ml or
zone ≥ 29 mm); PCR for
blaZ may be considered.

Oxacillin resistance Agar dilution; MHA ทีม่ ี 4% NaCl และ ไมต่ อ้ งทำ� การทดสอบเพม่ิ
6 μg/ml oxacillin

mecA-mediated Broth microdilution และ disk diffusion ไม่ตอ้ งทำ� การทดสอบเพิม่
oxacillin resistance ต่อยา cefoxitin

Vancomycin MIC Agar dilution; BHI ทีม่ ี 6 μg/ml ท�ำการทดสอบเพม่ิ หากให้
≥ 8 μg/ml vancomycin ผลบวก

Inducible Broth microdilution และ disk diffusion ไมต่ ้องทำ� การทดสอบเพิ่ม
clindamycin ต่อยา clindamycin และ erythromycin
resistance

High-level mupirocin Broth microdilution และ disk diffusion ไม่ตอ้ งทำ� การทดสอบเพมิ่
resistance ตอ่ ยา mupirocin

ค่มู อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

264 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจุลชีพ

Resistance วิธตี รวจคัดกรอง การทดสอบยืนยันเพ่ิม
เช้อื Phenotype หรือ

กลไกการดื้อยา

Coagulase-negative β–lactamase Chromogenic cephalosporin หรือวธิ ีอืน่ Yes, if screen test negative,
staphylococci production repeat penicillin MIC and
induced β-lactamase test
on subsequent isolates from
same patient (if penicillin
MIC ≤ 0.12 μg/ml or
zone ≥ 29 mm); PCR for
blaZ may be considered

mecA-Mediated Disk diffusion ตอ่ ยา cefoxitin ไมต่ อ้ งท�ำการทดสอบเพิ่ม
oxacillin resistance

Inducible Broth microdilution และ disk diffusion ตอ่ ไมต่ อ้ งท�ำการทดสอบเพ่ิม
clindamycin ยา clindamycin และ erythromycin
resistance

Enterococci Vancomycin Agar dilution; BHI with 6 μg/ml ท�ำการทดสอบเพ่ิมหากให้
resistance vancomycin ตอ่ ยา vancomycin ผลบวก

HLAR Broth microdilution, agar dilution, และ หากหา MIC ไมต่ ้องทำ� การ
disk diffusion ตอ่ ยา gentamicin และ ทดสอบเพิ่ม
streptomycin หากท�ำ disk ถา้ สรุปผลไม่ได้
ใหท้ �ำเพ่มิ

Streptococcus Penicillin resistance Disk diffusion ตอ่ ยา oxacillin ทำ� การทดสอบเพม่ิ หากเชอ้ื ให้
pneumoniae ผล nonsusceptible

Inducible Broth microdilution และ disk diffusion ไมต่ ้องท�ำการทดสอบเพม่ิ
clindamycin ต่อยา clindamycin และ erythromycin
resistance

Streptococcus spp. Inducible Broth microdilution และ disk diffusion ไม่ต้องท�ำการทดสอบเพิม่
β-hemolytic group clindamycin ต่อยา clindamycin และ erythromycin
resistance

ค�ำยอ่ : ESBL, extended-spectrum β-lactamase; FDA, US Food and Drug Administration;HLAR, high-level aminoglycoside
resistance; MIC, minimal inhibitory concentration; PCR, polymerase chain reaction.
* If the current cephalosporin, aztreonam, and carbapenem breakpoints are used, ESBL and/or modified Hodge testing is not
required, but may be used to determine the presence of a resistance mechanism that may be of epidemiological significance.
However, if the ESBL and/or carbapenemase screen is performed and positive, the confirmatory test must be performed to
establish the presence of an ESBL or a carbapenemase.

คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจลุ ชพี 265

สาเหตขุ องความผิดพลาดทพ่ี บบอ่ ยในการทดสอบความไวของเช้อื ตอ่ สารต้านจลุ ชพี ไดแ้ ก่
- การบนั ทึกผลผดิ พลาดหรอื ใช้ยาไม่ถกู ตอ้ ง
- การวินจิ ฉยั เชือ้ ตัวอย่างผดิ พลาด
- วิธีการทดสอบไมถ่ ูกต้องตามเกณฑม์ าตรฐาน
การเตรยี ม inoculum ขนุ่ มากหรอื นอ้ ยเกนิ ไป
ความขุ่นมาตรฐานหมดอายุหรือเปล่ยี นสภาพ
อุณหภูมใิ นการอบเชือ้ ไม่ถูกตอ้ ง
คา่ ความเป็นกรด-ดา่ ง (pH) ของอาหารเลยี้ งเช้ือ สงู หรอื ต่�ำเกนิ ไป
- ยาทีใ่ ชท้ ดสอบเสอ่ื มคณุ ภาพหรือหมดอายุ
- เช้ือทีใ่ ช้ทดสอบมกี ารปนเปอ้ื น
- การอ่านผลผิดพลาด
- inhibition zone เลก็ เกนิ ไปหรอื มเี ช้อื เจรญิ อยูภ่ ายใน zone (โดยเฉพาะยา sulfonamide, trimethoprim
และ co-trimoxazole) กรณีนี้อาจเกดิ จากสารยบั ย้ังในอาหารเลย้ี งเช้อื จึงควรทดสอบดว้ ย E. faecalis
ดงั กลา่ วแล้วขา้ งต้น

การตรวจสอบผลการทดสอบ 6บทที่

ตรวจสอบว่าแบบแผนความไวของเช้ือต่อยาสอดคล้องกันหรือไม่ หรือตรวจสอบจากผลการทดสอบ
ความไวของเช้ือชนิดเดียวกันที่แยกได้จากผู้ป่วยก่อนหน้าน้ี และให้หาสาเหตุของความผิดพลาดที่กล่าวแล้ว
ขา้ งตน้
นอกจากนี้ เช้อื บางสปีชสี ์จะใหแ้ บบแผนการด้ือยาทแ่ี นน่ อนอยู่แลว้ เช่น
- Proteus spp. โดยทั่วไปจะด้ือต่อยา nitrofurantoin และ tetracyclines
- Streptococcus pyogenes จะไวต่อยา penicillin เสมอ
- Serratia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp. และ Klebsiella pneumoniae จะดื้อยา ampicillin
- staphylococci และ streptococci จะไวต่อ vancomycin (หากพบเชื้อทั้งสองด้ือต่อยา vancomycin
ให้ตรวจสอบยืนยันการแยกชนิดเชอื้ อีกคร้ังเน่อื งจากเชื้อ Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. และ
Pediococcus spp. ดื้อ vancomycin)
- Shigella spp. จะไวตอ่ ยา norfloxacin
หากพบเชอ้ื ทใี่ หผ้ ล antibiogram ตา่ งไปจากปกตแิ ละมคี วามสำ� คญั ทางระบาดวทิ ยา เชน่ พบ norfloxacin
-resistant Shigella, vancomycin-resistant Staphylococcus ควรส่งเช้ือดังกล่าว ตรวจยืนยันที่สถาบันวิจัย
วทิ ยาศาสตรส์ าธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ เจา้ หนา้ ทห่ี อ้ งปฏบิ ตั กิ ารควรมขี อ้ มลู และตดิ ตามขา่ วสาร
เกี่ยวกบั typical, atypical, unusual หรือ impossible antibiogram อยา่ งสมำ่� เสมอ

คู่มือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรยี และรา

266 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารต้านจลุ ชพี

เช้อื ที่ควรท�ำการแยกชนิดและทดสอบความไวตอ่ ยาซ้�ำใหม่
ผลการทดสอบความไวของจุลชีพต่อสารต้านจุลชีพท่ีมีข้อช้ีบ่งต่อไปนี้ ต้องท�ำการทดสอบซ�้ำใหม่ทั้ง
การแยกและพิสจู นช์ นิดของเชื้อและการทดสอบความไวดว้ ยวิธเี ดมิ อกี ครง้ั เมอื่ ทำ� ซ�้ำแลว้ ไดผ้ ลดือ้ เหมอื นเดมิ
ใหท้ ำ� การยืนยันดว้ ยวิธีอ่ืนและหรือสง่ ให้ห้องปฏิบัติการอา้ งองิ ตรวจยืนยันการด้ือยา
ขอ้ บ่งชีเ้ ช้อื ทค่ี วรท�ำการแยกชนดิ และทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ ซ้�ำใหม:่ -
1) เชอ้ื ทไ่ี ม่เคยมีการรายงานมากอ่ น
2) เช้อื ท่ีพบไม่บ่อยในพ้ืนท่ีท่แี ยกเช้ือได้ แตเ่ คยมีรายงานในพน้ื ทอี่ น่ื หรือพ้ืนท่ีใกลเ้ คียง
3) เชอื้ ทใี่ หผ้ ลการทดสอบทสี่ ามารถเกดิ ความผดิ พลาดดา้ นเทคนคิ ไดง้ า่ ย และการดอ้ื ยานมี้ ผี ลกระทบ
ทางคลนิ ิกท่ีสำ� คญั

การควบคมุ คณุ ภาพภายนอก
หอ้ งปฏิบตั ิการควรได้รบั การทดสอบจากหนว่ ยงานภายนอก

2. การทดสอบความไวของเช้อื ต่อสารต้านจลุ ชีพโดยการหาค่า MIC

2.1 หลกั การ เปน็ การทดสอบความไวของเชอ้ื ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี แบบปรมิ าณวเิ คราะห์ โดยการผสมสาร
ตา้ นจลุ ชพี ทม่ี คี วามเขม้ ขน้ จากสงู ไปหาตำ�่ กบั อาหารเลยี้ งเชอ้ื แลว้ ใสเ่ ชอื้ ลงไป นำ� ไปอบเพาะเชอ้ื ขา้ มคนื ในตอู้ บ
35 OC ท�ำการตรวจหาความเข้มข้นต�่ำสุดของสารต้านจุลชีพที่สามารถยับย้ังการเจริญของเชื้อท่ีทดสอบ เรียก
ว่า minimum inhibitory concentration หรือ MIC การหาค่า MIC ทำ� ไดส้ ามวธิ คี อื วิธีทใ่ี ช้อาหารเลย้ี งเช้อื ชนดิ
วนุ้ ผสมกบั ยาต้านจุลชีพ เรียกวา่ agar dilution method วิธที ผ่ี สมยาตา้ นจลุ ชพี ด้วยอาหารเหลว เรียกว่า broth
dilution method และวธิ ี E-test สำ� หรบั วิธี broth dilution สามารถกระทำ� ได้ 2 วธิ ีได้แก่ macrodilution และ
microdilution broth method ซึ่งวิธีหลังเป็นวิธีที่นิยมมากกว่าเพราะส้ินเปลืองสารน้อยกว่า จึงขอน�ำมากล่าว
ไว้ในท่ีนี้โดยจะกล่าวถึงวิธีท่ีเหมาะส�ำหรับเชื้อเจริญง่ายใน Mueller-Hinton Broth (MHB) ส�ำหรับเช้ือที่
เจรญิ ยากหรอื พบนอ้ ย (Bacillus spp., Brucella spp., Burkholderia pseudomallei, Corynebacterium diphtheriae,
Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes, Yersinia pestis เปน็ ต้น) สามารถอ่านเพม่ิ เตมิ ใน CLSI
M45-A2 และส�ำหรับเชอื้ กล่มุ anaerobe อา่ นเพิม่ เติมใน CLSI M11-A7 ซง่ึ ใช้ broth แตกต่างกนั ตามชนิดของ
เชือ้ แบคทีเรยี

2.2 วธิ ปี ฏบิ ัติ
2.2.1 วิธีการทดสอบความไวของเชื้อต่อสารต้านจุลชีพโดยการหาค่า MIC ด้วยวิธี Agar dilution


คมู่ อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ต่อสารตา้ นจลุ ชีพ 267

การเตรียมสารตา้ นจุลชีพ
1. เตรียมสารตา้ นจุลชีพให้เป็น 10 เท่าของปริมาณยาทต่ี อ้ งการให้มใี นอาหารจานเพาะเชอ้ื แต่ละ plate
โดยเจอื จางยาต้านจลุ ชีพใหเ้ ปน็ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 … เชน่ เตรยี มยา 1280, 640, 320, 160, 80, 40,
20, 10 และ 5 µg/ml
2. ใสย่ าท่ีเตรียมไวแ้ ต่ละความเขม้ ขน้ plate ละ 1 ml แล้ว ผสมกบั MHA ท่มี ีความร้อนประมาณ 56 OC
ปริมาณ 9 ml จะได้ความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพใน agar dilution plate เรียงจากมากไปหาน้อย
ดงั นี้ 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, และ 0.5 µg/ml
3. รอให้ agar dilution plate เย็นและแข็งที่อุณหภูมิห้อง อาหารเลี้ยงเช้ือที่มียาต้านจุลชีพผสมอยู่
สามารถเก็บท่ี 4 OC ได้ไม่เกนิ 5 วัน ยกเว้นยากลมุ่ β-lactamases ต้องใช้ภายใน 48 ช่ัวโมง เนอื่ งจาก
ยาสลายตัวง่าย
4. ท�ำหน้า plate ให้แห้งก่อนน�ำไปใช้โดยใส่ในตู้อบเพาะเช้ือหรือวางแบบเปิดฝาใน laminar flow
หรือ BSC ประมาณ 15 นาที

การเตรยี มเชื้อแบคทีเรีย 6บทท่ี

เตรียมเช้อื โดยวิธี direct colony หรอื growth method เช่นเดียวกับท่ีกลา่ วไวใ้ นวธิ ที ดสอบความไวของ
เชือ้ ตอ่ ยาดว้ ยวธิ ี disk diffusion ใหไ้ ด้เชอื้ ทค่ี วามขนุ่ เท่ากับ 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน TSB แลว้
เจือจางเช้อื ลงอีก 1: 10 เท่าจะได้ความเข้มข้นของเชื้อ 5x107 CFU/ml ปรมิ าณเช้ือสดุ ทา้ ยท่อี ยูบ่ น agar dilution
plate เท่ากับ 104 CFU ต่อหยด เมื่อใช้ replicators ท่ีมีเข็มขนาด 1 mm ซ่ึง สามารถปล่อยเชื้อได้ 0.1-0.2 µl
ไม่ควรเตรยี มเชอ้ื นานเกนิ 15 นาที กอ่ นใสเ่ ชื้อบน plate

การใสเ่ ช้อื บน Agar dilution plates

1. จดั เรยี งเชอ้ื ทเ่ี ตรียมไวใ้ ห้เป็นลำ� ดบั โดยสามารถทำ� เชอื้ ได้ 30-32 สายพนั ธุ์
2. ท�ำเคร่ืองหมายท่ี plate เพือ่ ให้ร้ตู �ำแหนง่ และทศิ ทางการเรียงหมายเลขเช้อื แตล่ ะตัวบน agar plate
3. ดดู เชือ้ ที่เตรยี มไว้แต่ละตวั ประมาณ 0.5 ml ใส่ในแต่ละหลุมของ inoculator ตามลำ� ดับ
4. น�ำ inoculator-replicator ไปวางในหลมุ ของ inoculator แล้วน�ำไปวางบน agar plate เพือ่ ปล่อยให้
เช้ือหยดบนผิว plate ควรหยดเช้ือบนผิว agar ท่ีเป็น control plate ซึ่งไม่มียาต้านจุลชีพ
กอ่ น plate ที่มียาโดยเรยี งจากยานอ้ ยไปหามาก
5. รอจนหยดเชื้อแห้งสนทิ จึงน�ำ plate อบที่ 35+ 2 OC เปน็ เวลา 18-24 ช่ัวโมง

คมู่ ือการปฏิบัตงิ านแบคทีเรียและรา

268 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียตอ่ สารตา้ นจุลชีพ

การอ่านคา่ MIC

อ่านคา่ MIC ของเช้ือแต่ละตวั โดยเรียงจาก plate ทมี่ ียาน้อยท่ีสดุ ไปหายามากเพอื่ หาว่าเชอ้ื มี completely
inhibit growth (ไม่มีการเจริญของเชื้อหรือมีเพียงรอยเช้ือที่จางๆ) บน plate ท่ีมียาต้านจุลชีพปริมาณเท่าใด
คา่ ของ MIC ของเชื้อแตล่ ะตวั คือปริมาณยานอ้ ยท่ีสุดท่ีสามารถยบั ย้ังการเจรญิ ของเชอ้ื ได้
ข้อควรระวงั กรณมี ีเช้อื ข้นึ > 2 โคโลนี กอ่ นจดุ ทเ่ี ปน็ end point ของเช้ือ หรือกรณเี ชอื้ ไม่ขึน้ บน plate ทมี่ ียา
นอ้ ยแต่มีเชอ้ื เจรญิ บน plate ท่มี ียามากกวา่ ใหต้ รวจสอบการปนเปอื้ นของเช้อื อน่ื และตอ้ งทำ� การทดสอบใหม่
การควบคมุ คณุ ภาพ

Control plate: ใชอ้ าหารเพาะเลี้ยงเชือ้ ทีไ่ มเ่ ตมิ ยาตา้ นจลุ ชพี เพ่อื ควบคมุ การเจรญิ เติบโตของเชอื้ ท่ที ดสอบ
Drug control: ใชเ้ ชอ้ื มาตรฐานทท่ี ราบคา่ MIC ทดสอบควบคกู่ บั เชอ้ื ทดสอบใน agar dilution plate เดยี วกนั

ตารางท่ี 6-8 แสดงการหาคา่ MIC ของเช้อื โดยวิธี agar dilution

Strain No. Antimicrobial concentration in agar dilution plate (µg/ml) MIC (µg/ml)
0.5 1 2 4 8
8
1 +++ +++ +++ +++ NG 4
2
2 +++ +++ +++ NG NG 2
1
3 +++ +++ NG NG NG 1
1
4 +++ +++ NG NG NG 1
1
5 +++ NG NG NG NG 1
1
6 +++ NG NG NG NG NG

7 +++ NG NG NG NG

8 +++ NG NG NG NG

9 +++ NG NG NG NG

10 +++ NG NG NG NG

Control strain +++ NG NG NG NG

Negative control NG NG NG NG NG

+++ คอื มีการเจรญิ ของเชือ้ ; NG คือไม่มเี ชือ้ เจริญ

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รยี ต่อสารตา้ นจลุ ชพี 269

2.2.2 วธิ กี ารทดสอบความไวของเชอื้ ต่อสารตา้ นจลุ ชีพโดยการหาค่า MIC ด้วยวิธี Broth dilution
1. เตรยี ม Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth (CAMHB มชี นดิ สำ� เรจ็ รปู ขาย) เปน็ อาหารเลยี้ ง
เช้อื สำ� หรับผสมยา (กรณีท่ตี อ้ งทดสอบหาความไวของเช้ือกลมุ่ staphylococci ตอ่ ยา oxacillin,
methicillin หรือ nafcillin ใหเ้ ตมิ 2 % NaCl ลงกอ่ นน�ำไปนึ่ง)
2. ทดสอบค่า pH ซงึ่ ควรอยู่ในชว่ ง 7.2-7.4

การเตรยี มสารละลายสารตา้ นจุลชพี

1. คำ� นวณหา potency ของยาจากค่าท่ีกำ� หนดมาในใบ certificate ที่แนบมากบั ยา ดังตวั อยา่ ง

Assay purity (by HPLC): 99.8%, water content: 12.1% (w/w), Active fraction: 100%

Potency = (assay purity) x (active fraction) x (1-water content)

= 998 x 1 x (1-0.121)

= 877 µg/mg or 87.7%

ยาบางชนิดแสดงค่า potency เป็น IU/mg เขียนอยู่บนฉลากปิดขวด ให้ค�ำนวณเป็น µg/mg

ดังตัวอย่าง amphotericin 100 mg potency = 5,000 IU/mg = 5,000 IU/1,000 µg
ใชส้ ูตร
1 IU = 15 ,,00 0000 IµU g = 0.2 µg 6บทท่ี

Amphotericin มี potency = 5000 IU x 0.2 µg = 1,000 μg /mg

2. ค�ำนวณหาน้ำ� หนกั ยาทตี่ อ้ งช่ังซงึ่ ควรมากกวา่ 100 mg เพ่อื เตรยี ม stock solution
ตัวอย่าง เช่น ต้องการเตรียม stock solution 100 ml ที่มีความเข้มข้นของยา 1280 g/ml ยามี
potency 750 g/mg

ใช้สูตร weight = volume (mplo)txenccoync(µengt/rmatgi)on (µg/ml)
= 1 00 m7 l5x0 1µ2 g 8 / m0 g µ g / m l = 170.67 mg

เพื่อความถูกต้องควรชั่งยามากกว่าค่าท่ีค�ำนวณได้ หากเลือกชั่งยา 182.6 mg จะใช้ตัวท�ำละลาย
ปริมาตรเทา่ ใด ใช้สตู ร

volume = westiogchkt (cmongc)exnptroatteionncy(µ(µg/gm/ml)g)
= 1 82. 61 2m8 g0 x µ g 7 / 5m 0 l µ g / m g = 107.0 ml

คู่มือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรยี และรา

270 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารต้านจุลชีพ

นัน่ คอื ช่งั ยา 182.6 mg ละลายในนำ้� กลน่ั ปราศจากเชื้อ 107.0 ml เพอื่ เตรียม stock solution ท่ีมคี วามเข้มข้น
ของยา 1280 μg /ml
3. ส�ำหรับยาท่ีละลายได้ง่ายในน้�ำกล่ันปราศจากเชื้อ เตรียม stock solution ของยาให้มีความเข้มข้น
ไมน่ อ้ ยกวา่ 1,000 µg/ml (ยาทไี่ มล่ ะลายในนำ้� ใหล้ ะลายยาดว้ ยตวั ทำ� ละลายในปรมิ าตรนอ้ ยทสี่ ดุ ทสี่ ามารถทำ� ให้
ยาละลายจนหมด) เตรียมยาให้มีระดับความเข้มข้นมากพอท่ีจะครอบคลุมช่วงความเข้มข้นท่ียอมรับได้
ของเชื้อควบคุมคุณภาพการทดสอบอย่างน้อย 1 ชนิด stock solution ที่เตรียมด้วยวิธีปลอดเช้ือไม่จ�ำเป็น
ตอ้ งกรอง และสามารถเก็บทอี่ ณุ หภมู ิน้อยกวา่ หรอื เท่ากบั -20 OC ได้นาน 6 เดอื น
4. ท�ำการเจอื จาง stock solution ดว้ ย CAMHB ใหม้ คี วามเขม้ ข้นลดลง 10 เทา่ เปน็ working solution
จากน้นั เจือจาง working solution ท่ไี ดใ้ ห้มคี วามเข้มขน้ สุดทา้ ยของยาลดลง 2 เทา่ (ดงั ตารางที่ 6-9) โดยเปล่ยี น
pipette ทุกครัง้ หลงั การเจือจางแตล่ ะความเข้มข้น

ตารางที่ 6-9 ตวั อย่างแสดงการเตรียม working solution

ความเขม้ ขน้ ของยา ปริมาตรของยา ปริมาตรของ CAMHB ความเขม้ ข้นสดุ ทา้ ยของยา

(µg/ml) (ml) (ml) (µg/ml)

5120 (stock solution) 1 9 512

512 1 1 256

512 1 3 128

512 1 7 64

64 1 1 32

64 1 3 16

64 1 7 8

811 4

813 2

817 1

111 0.5

113 0.25

117 0.125

ดูด CAMHB ทผี่ สมยา ใสล่ งถาด 96 หลุม (กน้ หลมุ แบบตวั U หรือ V) หลุมละ 0.1 ml โดยเริม่ จาก

ความเข้มข้นของยาต�่ำสุดไปหาสูงสุด แต่ละความเข้มข้นจะมี 8 หลุม (แถวA-H) ดังรูป และดูด CAMHB ที่

ไมผ่ สมยาลงในหลุมที่ A12-H12 หลมุ ละ 0.1 ml

คู่มือการปฏิบัติงานแบคทเี รียและรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รยี ตอ่ สารต้านจุลชพี 271

ความเขม้ ข้นของยา (μg/ml)

ภาพที่ 6-1 ตวั อยา่ งการทดสอบหาค่า MIC ดว้ ยวิธี broth microdilution 6บทท่ี

การเตรียมเช้อื แบคทเี รยี
1. เตรียมเชอื้ โดยวิธี direct colony หรือ growth method เชน่ เดยี วกับท่กี ลา่ วไว้ในวิธที ดสอบความไว
ของเชอ้ื ตอ่ ยาดว้ ยวธิ ี disk diffusion ใหไ้ ดเ้ ชอ้ื ทคี่ วามขนุ่ เทา่ กบั 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน CAMHB
แล้วเจือจางเชอ้ื ลงอกี 20 เท่าจะไดค้ วามเขม้ ขน้ ของเชอื้ 5x106 CFU/ml
2. ดูดเช้ือแต่ละสายพันธ์ุใส่หลุม 1-12 ของแต่และแถว (A-F) หลุมละ 0.01 ml ภายใน 15 นาที
(ความเขม้ ขน้ สดุ ทา้ ยของเชอ้ื จะลดลงเปน็ 5x105 CFU/ml) ดงั รปู โดยหลมุ G1-G12 ใชเ้ ปน็ หลมุ ทใ่ี สเ่ ชอื้ ควบคมุ
และหลมุ ท่ี H1-H12 ใช้เปน็ หลมุ ควบคุมทไ่ี ม่ใสเ่ ชือ้ แบคทีเรยี
3. อบถาดหลมุ ขา้ มคนื ทอ่ี ุณหภูมิ 35+2 OC ในกลอ่ งพลาสตกิ โดยไมซ่ อ้ นถาดมากกวา่ 4 ถาด

การอา่ นผล
1. ตรวจดูหลุมแรกที่ไม่พบการเจริญของเช้ือแต่ละตัวที่ท�ำการทดสอบ อ่านค่าความเข้มข้นของยา
ในหลมุ น้นั เปน็ ค่า MIC
2. หากพบหลุมที่ไม่มีการเจริญของเชื้ออยู่ระหว่างกลาง ให้อ่านค่า MIC ที่สูงสุด แต่หากพบหลุม
ดังกลา่ วมากกว่า 1 หลุมใหท้ ำ� การทดสอบใหม่

คมู่ อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

272 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รยี ต่อสารตา้ นจุลชพี

การควบคมุ คณุ ภาพ

1. ทดสอบกับเช้ือควบคุมตามที่ก�ำหนดใน CLSI M100-S24 ควบคู่กับเชื้อแบคทีเรียตัวอย่างทุกคร้ัง
ทท่ี ำ� การทดสอบ
2. ต้องไม่พบการเจริญของเช้ือในหลุมของแถว H1-H12 และต้องพบการเจริญที่ดีของเชื้อในหลุม
A12-G12

ตารางที่ 6-10 แสดงเชื้อแบคทีเรียทคี่ วรทดสอบความไวดว้ ยวิธี broth microdilution

Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Abiotrophia spp. CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin
Granulicatella spp. + LHB 2.5-5% suspension 20-24 ชม. ATCC 49619 cefotaxime หรอื
+ pyridoxal in MHB ceftriaxone
hydrochloride vancomycin

Bacillus spp. ยกเว้น CAMHB direct colony 35 OC S. aureus vancomycin
B. anthracis suspension in 16-20 ชม. ATCC 29213 fluoroquinolones
MHB clindamycin

Campylobacter CAMHB direct colony 36-37 OC C. jejuni erythromycin
jejuni/coli + LHB 2.5-5% suspension in 48 ชม. ATCC 33560 ciprofloxacin
หรือ 42 OC
MHB 24 ชม.
microaerobic

Corynebacterium spp. CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin
(รวม C. diphtheriae) + LHB 2.5-5% suspension in 24-48 ชม. ATCC 49619 vancomycin
E. coli ATCC gentamicin
MHB 25922 กบั ยา erythromycin
gentamicin

Erysipelothrix CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin หรือ
rhusiopathiae + LHB 2.5-5% suspension in 20-24 ชม. ATCC 49619 ampicillin

MHB

กลมุ่ HACEK CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae ampicillin
+ LHB 2.5-5% suspension in 24-48 ชม. ATCC 49619 amoxicillin-
E. coli ATCC clavulanic acid
MHB 5% CO2 35218 กบั ยาท่ี cefotaxime
มี β-lactamase หรือceftriaxone
inhibitor imipenem

คูม่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รยี ต่อสารต้านจุลชพี 273

Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Leuconostoc spp. CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin หรือ
+ LHB 2.5-5% suspension in 20-24 ชม. ATCC 49619 ampicillin
E. coli ATCC
MHB 25922 กบั ยา
gentamicin

Listeria CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin หรอื
monocytogenes + LHB 2.5-5% suspension in 20-24 ชม. ATCC 49619 ampicillin
trimethoprom-
MHB sulfamethoxazole

Moraxella catarrhalis CAMHB direct colony 35 OC S. aureus amoxicillin
suspension in 20-24 ชม. ATCC 29213 -clavulanic acid
MHB cefaclor หรอื
cefuroxime

Pasteurella spp. CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae ยากลุ่ม penicillins, 6บทที่
+ LHB 2.5-5% suspension in 18-24 ชม. ATCC 49619 cephalosporins,
E. coli ATCC tetracyclines,
MHB 35218 กับยาที่ fluoroquinolones
มี β-lactamase
inhibitor

Pediococcus spp. CAMHB direct colony 35 OC S. pneumoniae penicillin
+ LHB 2.5-5% suspension in 20-24 ชม. ATCC 49619 cefotaxime
E. coli ATCC หรือ
MHB 25922 กบั ยา ceftriaxone
gentamicin vancomycin

Acinetobacter spp. CAMHB direct colony 35±2 OC E. coli colistin
suspension in 20-24 ชม. ATCC 25922
MHB P. aeruginosa
ATCC 27853

คูม่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

274 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจุลชีพ

Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Bacillus anthracis CAMHB direct colony 35 OC E. coli penicillin
suspension in 16-20 ชม. ATCC 25922 doxycycline
CAMHB S. aureus ciprofloxacin
ATCC 29213

Brucella spp. Brucella broth direct colony 35 OC E. coli gentamicin
pH 7.1 ±0.1 suspension in 48 ชม. ATCC 25922 streptomycin
S. pneumoniae tetracycline
CAMHB ATCC 49619

Burkholderia mallei CAMHB direct colony 35 OC E. coli ceftazidime
suspension in 16-20 ชม. ATCC 25922 imipenem
CAMHB P. aeruginosa tetracycline
ATCC 27853

Burkholderia CAMHB direct colony 35 OC E. coli ceftazidime
pseudomallei suspension in 16-20 ชม. ATCC 25922 imipenem
CAMHB P. aeruginosa tetracycline
ATCC 27853 amoxicillin-
clavulanic acid

Franciscella CAMHB direct colony 35 OC E. coli gentamicin
tularensis + 2% suspension in 48 ชม. ATCC 25922 streptomycin
defined growth CAMHB S. aureus tetracycline
supplement ATCC 29213 ciprofloxacin
P. aeruginosa chloramphenicol
ATCC 27853

Yersinia pestis direct colony 35±2 OC E. coli gentamicin
suspension in 24-48 ชม. ATCC 25922 streptomycin
CAMHB tetracycline
ciprofloxacin
trimethoprom-
sulfamethoxazole

LHB: Lysed Horse Blood
HACEK: Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter paraphrophilus, Aggregatibacter segnis,
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium spp., Eikenella corrodens,
Kingella spp.
Microaerobic: 10% C02, 5% O2, 85% N2

คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียตอ่ สารตา้ นจุลชีพ 275

3. β-lactamase test

3.1 หลกั การ β-lactamase เปน็ เอนไซมท์ แี่ บคทเี รยี หลายชนดิ สรา้ งขน้ึ เพอื่ ทำ� ลายยากลมุ่ β-lactam ดงั นนั้

การตรวจหาการสรา้ งเอนไซม์ β-lactamase ซึ่งสามารถกระท�ำไดอ้ ยา่ งรวดเรว็ ในแบคทีเรียกลุ่ม Haemophilus

spp., N. gonorrhoeae, staphylococci, enterococci และ M. catarrhalis จะชว่ ยใหก้ ารรกั ษาดว้ ยสารตา้ นจุลชีพมี

ประสทิ ธภิ าพมากขนึ้ วธิ ที ดสอบมี 3 วธิ ไี ดแ้ ก่ acidometric, iodometric และ nitrocefin-based (cefinase) method

ซงึ่ วธิ สี ดุ ทา้ ยเปน็ วธิ ที สี่ ามารถใชท้ ดสอบกบั เชอื้ ทกุ กลมุ่ ดงั กลา่ วขา้ งตน้ จงึ เปน็ วธิ ที น่ี ยิ มมากทส่ี ดุ และจะนำ� มา

กลา่ วไว้ในที่นี้

3.2 วธิ ปี ฏบิ ตั ิ

3.2.1 วาง cefinase disk บนแผน่ สไลดท์ ่สี ะอาด หยดนำ้� กลั่นปราศจากเชือ้ 1 หยดลงบน disk

3.2.2 ใช้ loop หรอื swab เข่ียเชื้อที่ตอ้ งการทดสอบนำ� มาปา้ ยลงบน cefinase disk

3.2.3 ตรวจดูการเปลีย่ นสีของ disk ผลบวกคือเชื้อสร้าง β-lactamase ไปเปลี่ยน substrate ใน disk

เปน็ สแี ดงภายใน 15 วนิ าที ถงึ 5 นาที แตถ่ า้ ทดสอบเชอ้ื staphylococci ตอ้ งอา่ นผลหลงั ปา้ ยเชอ้ื

1 ชม. และถ้าทดสอบเช้อื enterococci ต้องอ่านผลหลงั ปา้ ยเชอ้ื 30 นาที ผลลบคือ เชือ้ ไมส่ รา้ ง

β-lactamase จะไม่เห็นการเปล่ียนแปลงสีของ disk

หมายเหตุ การทดสอบกับเช้ือ staphylococci ควรทดสอบกับเชื้อท่ีถูกเหน่ียวน�ำ ให้สร้างเอนไซม์เพ่ิมข้ึน 6บทท่ี

(ตามวิธีข้างล่าง) เนื่องจากบางสายพันธ์ุสร้าง β-lactamase ในปริมาณน้อยมากจนไม่สามารถตรวจสอบได้

3.3 วิธเี หนย่ี วนำ� การสรา้ งเอนไซม์ β-lactamase ใน staphylococci

3.3.1 Streak เชอ้ื บน BA เป็น 3 ระนาบ แลว้ วาง oxacillin disk (1 μg) ลงบนระนาบเช้ือ

3.3.2 อบเชอ้ื ท่ี 35± 2 OC นาน 16-18 ชม.

3.3.3 เขยี่ เชือ้ ท่ีเจรญิ ตรงขอบของ inhibition zone ไปทดสอบการสรา้ ง β-lactamase ข้างตน้

3.4 การรายงานผล

ผลบวก หมายถงึ เชอื้ ดอ้ื ตอ่ ยากลมุ่ penicillinase-labile penicillins (amoxicillin, ampicillin, penicillin

กรณี staphylococci จะรวมถึง carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin, และ piperacillin) หากได้ผลลบยัง

ไม่สามารถสรปุ ว่าเชอื้ ไมด่ ือ้ ยา ต้องท�ำการทดสอบความไวตามวิธีมาตรฐานกอ่ น

3.5 การควบคุมคณุ ภาพ

ทดสอบการสร้าง β-lactamase กับ reference strains ดังนี้

Staphylococcus aureus ATCC 29213 ใหผ้ ลบวก

Haemophilus influenzae ATCC 10211 ใหผ้ ลลบ

คู่มือการปฏิบัติงานแบคทีเรยี และรา

276 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อสารตา้ นจลุ ชีพ

4. ESBLs

4.1 หลักการ ESBLs เป็นเอนไซม์ β-lactamase ทเี่ ช้ือสรา้ งขน้ึ จากการ mutation ของยีน ท�ำใหส้ ามารถ
ท�ำลายยากลุ่ม penicillins, 3rd-generation cephalosporins (ceftazidime, cefotaxime, และ ceftriaxone) และ
aztreonam พบมากใน Enterobacteriaceae โดยเฉพาะ Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Escherichia coli
และ Proteus mirabilis ท่เี ป็นสาเหตกุ ารติดเชอ้ื ในโรงพยาบาล วธิ ที ต่ี รวจดูการสรา้ งเอนไซม์ ESBLs มีทง้ั วิธี
screening และ confirmation
4.2 วิธีปฏิบัติ
4.2.1 วิธี Screening
4.2.1.1 เตรียม inoculums และเพาะเชื้อบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของ
เช้ือต่อยาดว้ ยวธิ ี disk diffusion
4.2.1.2 ทดสอบความไวของเช้ือ K. pneumoniae, K. oxytoca และ E. coli ต่อยา
cefpodoxime (10 μg) หรือ ceftazidime (30 μg) หรือ aztreonam (30 μg) หรือ
cefotaxime (30 μg) หรือ ceftriaxone (30 μg) หากเป็นเช้ือ P. mirabilis ให้
ทดสอบกับยา cefpodoxime (10 μg) หรือ ceftazidime (30 μg) หรอื cefotaxime
(30 μg) อบเชอ้ื ที่ 35± 2 OC นาน 16-18 ชม.
4.2.1.3 วัดขนาด inhibition zone ของเช้ือ ถ้าได้ตามตารางท่ี 6-11 แสดงว่าเชื้ออาจสร้าง
เอนไซม์ ESBL ควรทำ� วิธี confirmation เพ่อื ยนื ยนั ตอ่ ไป

ตารางท่ี 6-11 ตาราง inhibition zone ของเชื้อในการทดสอบ ESBL

สารตา้ นจลุ ชพี ขนาด inhibition zone (mm) P. mirabilis
E. coli K. pneumoniae K. oxytoca ≤ 22
Cepodoxime (10 μg) ≤17 ≤17 ≤ 17 ≤ 22
Ceftazidime (30 μg) ≤ 22 ≤ 22 ≤ 22 -
Aztreonam (30 μg) ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27
Cefotaxime (30 μg) ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 -
Ceftriaxone (30 μg) ≤ 25 ≤ 25 ≤ 25

คูม่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อสารต้านจลุ ชีพ 277

4.2.2 วิธี Confirmation 6บทที่
4.2.2.1 เตรยี ม inoculums และเพาะเช้ือบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของ
เชื้อต่อยาด้วยวิธี disk diffusion จ�ำนวน 2 plate ต่อเช้ือ 1 ตัวตามมาตรฐานการ
ทดสอบความไวของเชื้อต่อยาดว้ ยวธิ ี disk diffusion
4.2.2.2 ทดสอบความไวของเชื้อต่อยา ceftazidime (30 μg) และยา ceftazidime-
clavulanic acid (30/10 μg) ใน plate ท่ี 1 และวาง disk ยา cefotaxime (30 μg)
และยา cefotaxime-clavulanic acid (30/10 μg) ใน plate ท่ี 2 อบเชอ้ื ที่ 35± 2 OC
นาน 16-18 ชม.
4.2.2.3 วดั เส้นผา่ นศนู ยก์ ลางของ inhibition zone ของยาแตล่ ะคู่ ถ้า inhibition zone ของ
disk ยาท่ีมีส่วนผสมของ clavulanic acid มีขนาดใหญ่กว่า inhibition zone ของ
disk ยาชนิดเดียวกันท่ีไม่มีส่วนผสมของ clavulanic acid ≥ 5 mm แสดงว่าเช้ือ
สรา้ งเอนไซม์ ESBL
4.3 การรายงานผล
รายงานว่าเชอ้ื สรา้ งเอนไซม์ ESBL
4.4 การควบคุมคุณภาพ
4.4.1 วิธี screening : ทดสอบความไวของเชื้อ E. coli ATCC 25922 (ไม่สร้างESBLs) ต่อยา
ดงั กล่าวขา้ งต้น สัปดาหล์ ะครง้ั
4.4.2 วิธี confirmation : ทดสอบความไวของเชือ้ E. coli ATCC 25922 (ไม่สรา้ งESBLs) และ เชือ้
K. pneumoniae ATCC 700603 (สร้างESBLs) ต่อยา ceftazidime (30 μg) คู่กับยา
ceftazidime-clavulanic และยา cefotaxime (30 μg) คู่กับยา cefotaxime-clavulanic acid
(30/10 μg) สปั ดาหล์ ะคร้ัง โดย inhibition zone ของเชือ้ E. coli ATCC 25922 ต่อยาท้ัง 2 คู่
จะต่างกัน ≤ 2 มม. และ inhibition zone ของเช้ือ K. pneumoniae ATCC 700603 ต่อยา
ceftazidime (30 μg) และยา ceftazidime-clavulanic จะตา่ งกนั ≥ 5 mm แตส่ ำ� หรบั ยาcefotaxime
(30 μg) คูก่ ับยา cefotaxime-clavulanic acid (30/10 μg) จะต่างกนั ≥ 3 mm

5. Carbapenemases detection

5.1 หลักการ carbapenemases activity ในเชือ้ Enterobacteriaceae ท่แี ยกไดจ้ ากสงิ่ ตรวจของผูป้ ว่ ย เกิด

จากการสรา้ งเอนไซม์ β-lactamase หลายชนดิ มที ้ังใน classes A, B และ D เช่นเอนไซม์ KPC ทอ่ี ยู่ใน class A
เอนไซม์ NDM ท่อี ยู่ใน class B และเอนไซม์ OXA ที่อยู่ใน class D ซ่ึงเป็นเอนไซม์หลกั ท่ีมีความสำ� คัญทาง
คลนิ กิ ดงั แสดงในตารางที่ 6-12

คมู่ ือการปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

278 บทท่ี 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจุลชพี

ตารางท่ี 6-12 β-lactamases และ carbapenemase activity

β-lactamase class เชอื้ ท่ีพบ ตวั อยา่ งเอนไซม์

A K. pneumoniae และ KPC, SME
Enterobacteriaceae อืน่ ๆ

B Enterobacteriaceae Metallo-β-lactamases
P. aeruginosa ท่ถี กู ยับยง้ั โดย EDTA
Acinetobacter baumannii เชน่ IMP, VIM, NDM

C Acinetobacter baumannii OXA
Enterobacteriaceae



Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases เปน็ กลไกการดื้อยา carbapenems ทส่ี �ำคญั carbapenemases

มีรายงานพบท่ัวโลกในเชือ้ Enterobacteriaceae เอนไซม์ carbapenemases ชนดิ KPC type มีรายงานคร้งั แรกใน

สหรัฐอเมรกิ าและมีระบาดมากในอิสราเอล และกรกี metallo-enzymes (VIM, IMP…) พบมากในทางใต้ของ

ยุโรปและเอเชีย OXA-48 เป็น carbapenemases ที่รายงานล่าสุดจากกลุ่มประเทศเมดิเตอร์เรเนียน และมี

โครงสร้างที่แตกต่างจาก carbapenemases อ่ืน carbapenemase genes ส่วนใหญ่อยู่ท่ี plasmid ของเชื้อ

K. pneumoniae ทแี่ ยกได้จากโรคตดิ เชือ้ ในโรงพยาบาลแต่มีรายงานการติดเชอื้ ในชมุ ชนดว้ ย

การตรวจยืนยันการสรา้ งเอนไซม์ KPC สามารถทำ� โดย modified Hodge test แตย่ ังไมม่ ี phenotypic test

ทเี่ ชอื่ ถอื ไดส้ ำ� หรบั การตรวจยนื ยนั หาเอนไซม์ NDM และ metallo-β-lactamases อยา่ งไรกต็ าม breakpoints ของ
การทดสอบความไวโดย disk diffusion method หรือการท�ำ MIC สำ� หรับยาในกลุ่ม carbapenem ทกี่ �ำหนดโดย

CLSI ใน M100-S20-U (June 2010 Update) สามารถใชแ้ ปลผลการทดสอบความไวของเชอ้ื Enterobacteriaceae

ท่ีสร้างเอนไซม์ชนิด NDM และ other metallo-β-lactamase เพื่อใช้เป็นแนวทางในการเลือกสารต้านจุลชีพ
ส�ำหรับการตดิ เชื้อดังกล่าว

การตรวจคัดกรองและการยืนยันการสร้าง carbapenemase ของเช้ือ Enterobacteriaceae โดยใช้เกณฑ์

การแปลผล CLSI June 2010 (M100-S20-U) การตรวจคัดกรองเบ้ืองต้นส�ำหรับการสร้าง carbapenemase

ของเชื้อ Enterobacteriaceae ให้ท�ำตามวิธีท่ีแสดงใน Table 3C ของ M100-S24; CLSI 2014 การทดสอบ

ความไวต่อสารต้านจุลชีพในงานบริการประจ�ำวัน การตรวจยืนยันการสร้าง carbapenemase ของเช้ือ

Enterobacteriaceae โดยวิธี Modified- Hodge test ท�ำเฉพาะกรณีต้องการศึกษาระบาดวิทยาเพื่อใช้ประโยชน์

ในการควบคุมการแพร่กระจายไม่จ�ำเป็นต้องท�ำในงานบริการประจ�ำวัน การแปลผลของการทดสอบความไว

ของยากลมุ่ carbapenem สำ� หรบั เชือ้ Enterobacteriaceae โดยวธิ ี disk diffusion และการหาค่า MIC ให้อิงตาม

break point ทีก่ �ำหนด โดยไม่ต้องคำ� นงึ ถงึ ผลของ Modified- Hodge test

คูม่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี 279

เชื้อ Enterobacteriaceae ที่สร้าง carbapenemase มักจะให้ผล intermediate หรือ resistant ต่อยาใน

กลุ่ม carbapenem อย่างน้อยหนึ่งชนิด ertapenem non-susceptibility เป็นตัวชี้วัดที่ไวดีส�ำหรับการตรวจหา

การสรา้ งเอนไซม์carbapenemaseและเชอ้ื กลมุ่ นม้ี กั ดอื้ ตอ่ ยาตวั ใดตวั หนงึ่ ในกลมุ่ cephalosporinsubclassIIIดว้ ย

เชน่ cefoperazone, cefotaxime, ceftriazone, ceftazidime ดงั นนั้ การตรวจหาการสรา้ งเอนไซม์ carbapenemases

สำ� หรบั Enterobacteriaceae ตอ้ งทำ� การทดสอบความไวของเชอื้ ตอ่ ยาทง้ั ertapenem, imipenem, และmeropenem

รวมทัง้ ยาในกล่มุ cephalosporin subclass III เสมอ

5.2 การตรวจคัดกรอง Carbapenemase production ของเชื้อ Enterobacteriaceae

5.2.1 วธิ ปี ฏบิ ตั ิ

5.2.1.1 ท�ำการทดสอบตามวิธี disk diffusion ด้วยแผ่นยาทดสอบ ertapenem 10 μg

หรือ meropenem 10 μg หรือวิธี broth dilution โดยใช้ยา ertapenem 1 μg หรือ

meropenem 1 μg หรือ imepenem 1 μg

5.2.1.2 อบจานเพาะเชอ้ื ท ี่ 35 ± 2 OC เปน็ เวลา 16-18 ชม. ส�ำหรับวธิ ี disk diffusion หรอื

16-20 ชม. ส�ำหรับ broth dilution

5.2.1.3 การตรวจคัดกรองถ้า inhibition zone ของ ertapenem = 19-21 mm หรือ

meropenem = 16-21 mm แสดงว่าเช้ือที่ทดสอบอาจมีการสร้างเอนไซม์ 6บทที่

carbapenemase
5.2.1.4 MICs ของ ertapenem = 2 μg/ml หรอื imepenem = 2-4 μg/ml หรือ meropenem
= 2-4 μg/ml แสดงวา่ เชอื้ ที่ทดสอบอาจมีการสร้างเอนไซม์ carbapenemase

5.2.1.5 กรณีได้ผลตรวจคัดกรองบวกต้องตรวจยืนยันโดยวิธี modified-Hodge test

หมายเหตุ ไมใ่ ช้ imepenem disk ในการตรวจคัดกรองหา carbapenemases เพราะใหผ้ ลไม่ดี

5.3 การตรวจยืนยันการสรา้ ง Carbapenemase ของเช้อื Enterobacteriaceae โดย modified-Hodge
test (MHT)

5.3.1 วธิ ีปฏบิ ตั ิ
5.3.1.1 เตรยี ม E.coli ATCC 25922 ใหไ้ ด้ความขุน่ 0.5 McFarland standard โดยวิธี direct
colony suspension หรอื growth method ใน broth หรือนำ�้ เกลือแลว้ เจอื จางให้เปน็
1:10 ใน broth หรือน้�ำเกลือ
5.3.1.2 ใช้ cotton swab ป้ายเชอ้ื ในข้อ 1 ลงบน MHA แบบเดียวกับการท�ำ disk diffusion
test

คมู่ อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

280 บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจลุ ชพี

5.3.1.3 หลงั ปล่อย plate ไว้ 3-10 นาทใี ห้แหง้ วางแผน่ ยาทดสอบ ertapenem ขนาด 10 μg
หรอื meropenem 10 μg ทก่ี ลาง plate
5.3.1.4 ใช้ loop ขนาด 10 μl เขยี่ เชอื้ ทจี่ ะทดสอบ 3-5 โคโลนที เี่ พาะบน BA นาน 18-24 ชม.
ปา้ ยเปน็ เสน้ ตรงลากจากแผน่ ยาทดสอบมาจนสดุ ขอบ plate ยาวอยา่ งนอ้ ย 20-25 mm
5.3.1.5 ท�ำการทดสอบในข้อท่ี 4 กับเชื้อมาตรฐานที่ใช้ควบคุมคุณภาพท้ังสายพันธุ์
MHT positive และ MHT negative
5.3.1.6 อบเช้อื ท่ีอณุ หภูมิ 35 ± 2OC เปน็ เวลา 16-20 ชม.
5.3.2 การอ่านผล
อา่ นผลโดยดกู ารเหนยี่ วนำ� การเตบิ โต (enhanced growth) ของเช้อื E. coli ATCC 25922 ที่
ตำ� แหนง่ ทต่ี ดั กบั เชอื้ ทที่ ดสอบ ถา้ พบ enhanced growth แสดงวา่ เชอื้ ทท่ี ดสอบมกี ารสรา้ ง carbapenemase หรอื
carbapenemase production บวก ถ้าไม่พบ enhanced growth คอื carbapenemase production ลบ
5.3.3 การรายงานผล
5.3.3.1 เช้อื ทใ่ี ห้ผล MHT positive และการตรวจคัดกรองโดย ertapenem หรือ meropenem
disk diffusion บวก (inhibition zone; ertapenem 19-21 mm meropenem 16-21 mm)
ต้องหาค่า MIC ก่อนรายงานผลการสรา้ ง carbapenemase
5.3.3.2 เชอื้ ทใี่ ห้ MHT positive และ ertapenem MIC 2 μg/ml, imipenem MIC 2-4 μg/ml,
หรอื meropenem MIC 2-4 μg/ml รายงาน carbapenem ทกุ ตวั วา่ ดื้อ
5.3.3.3 เช้ือท่ีให้ MHT negative แปลผล carbapenem MICs ตาม CLSI interpretive
criteria ตาราง 2A ใน M100-S24 (January 2014)
5.3.3.4 เช้ือ Enterobacteriaceae ที่สร้าง carbapenemase ไม่ได้ให้ผล MHT บวกทุกตัว
และ ผล MHT ที่บวกอาจพบในเช้ือสายพันธ์ุที่ดื้อ carbapenem ด้วยกลไกอื่นท่ี
ไม่ใชก่ ารสรา้ ง carbapenemase
5.3.3.5 MIC ของ imipenem ส�ำหรับ Proteus spp., Providencia spp. และ Morganella

morganii มักจะสูงกวา่ MIC ของ meropenem หรอื doripenem เช้อื เหล่าน้ีมี MIC
ต่อยา carbapenem สงู อาจเนื่องจากกลไกอนื่ ๆท่ีไมใ่ ช่การสรา้ ง carbapenemases
5.3.4 การควบคมุ คณุ ภาพ
เช้ือควบคุมคุณภาพต้องท�ำการทดสอบบนจานเพาะเล้ียงเดียวกับเช้ือที่ทดสอบ และต้องท�ำการ
ควบคุมคณุ ภาพทุกวนั ทีท่ �ำการทดสอบ ใช้เชือ้ K. pneumoniae ATCC BAA-1705 เป็น MHT positive control
และ K. pneumoniae ATCC BAA-1706 เปน็ MHT negative control

ค่มู ือการปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

บทที่ 6 การทดสอบความไวของแบคทเี รียต่อสารตา้ นจลุ ชพี 281

MAC ท่ี supplemented ด้วย imipenem 1 μg/ml สามารถใช้ตรวจคัดกรองหาเชือ้ carbapenem-
resistant Enterobacteriaceae (CRE) ท่ี colonize ในทางเดินอาหารได้ด้วยความไวมากกว่า 80% และความ
จ�ำเพาะมากกว่า 90% และสามารถใช้ตรวจหาเชื้อ carbapenem-resistant Enterobacteriaceae สายพันธุ์ที่มีค่า
carbapenem MIC ตำ�่ ๆได้ดว้ ย

6. การตรวจคัดกรองการดื้อยา aminoglycoside ระดบั สูงของเชอื้ Enterococcus spp.
6.1 หลักการ การด้อื ยา gentamicin และ/หรอื streptomycin ระดบั สูง ชบี้ ง่ วา่ เช้ือ enterococcal isolate
น้ันจะไม่ถูกท�ำลายโดยการเสริมฤทธิ์ของ penicillin หรือ glycopeptides รวมกับ aminoglycoside agar หรือ
broth ทมี่ ี gentamicin (500 µg/ml) หรอื streptomycin (1,000 μg/ml ในว้นุ หรอื 2,000 μg/ml ในอาหารเหลว)
ความเข้มข้นสูง สามารถใช้ในการตรวจคดั กรองการดือ้ ยาดงั กลา่ วได้ (ตาราง Screening test for Detection of
High-Level Aminoglycoside Resistance (HLAR) in Enterococcus species ใน M100) aminoglycosides อื่นๆ
นอกเหนอื จาก gentamicin และ streptomycin ไม่ตอ้ งน�ำมาตรวจคดั กรองเพราะไมไ่ ด้ผลที่ดกี วา่
Enterococci อาจดือ้ ยา penicillin และ ampicillin เนอ่ื งจาก มีการผลติ low affinity PBPs และอาจ
เกิดจากกลไกท่ีพบได้น้อยคือการผลิต β-lactamase ท้ัง agar และ broth dilition test สามารถตรวจหาเชื้อท่ี
มี altered PBPs ไดแ้ มน่ ย�ำ แตไ่ มส่ ามารถตรวจการผลิต β-lactamase ได ้ เช้อื β-lactamase-producing strains

of enterococci สามารถตรวจหาได้โดย nitrocefin based β-lactamase test ผลบวกของ β-lactamase test ใช้ บทท่ี

6ในการชบ้ี ง่ วา่ ดอื้ ตอ่ ยา penicillin เชอื้ enterococci ทม่ี ี ampicillin และ penicillin MICs > 16 µg/ml จดั วา่ ดอ้ื ยา

เชอ้ื enterococci ท่ดี ้ือ penicillin (MICs < 64 µg/ml) หรือ ampicillin (MICs < 32 µg/ml) ในระดบั ต�ำ่
อาจถกู ทำ� ลายโดยการเสรมิ ฤทธขิ์ อง penicillin ร่วมกบั gentamicin หรอื streptomycin ในกรณที ี่เช้อื ไม่ไดด้ ือ้ ยา
gentamicin หรือ streptomycin ในระดบั สูง และผปู้ ว่ ยได้รบั high dose of penicillin เช้ือทด่ี ื้อในระดับสูงตอ่ ยา
penicillin (MICs > 128 µg/ml) หรอื ampicillin (MICs > 64 µg/ml) อาจไมไ่ ด้ผลดีในการเสรมิ ฤทธิท์ ่ีกลา่ วมา

6.2 Disk diffusion test
6.2.1 วิธปี ฏบิ ัติ
6.2.1.1 ป้ายเช้ือที่มีความเข้มข้นเท่ากับ 0.5 McFarland ลงบน MHA ตามวิธีการ
Standard disk diffusion test
6.2.1.2 วางแผ่นยาทดสอบ gentamicin 120 μg หรือ streptomycin 300 μg ลงบนจาน
เลยี้ งเชอื้ ในข้อ 6.2.1.1
6.2.1.3 อบเชื้อท่ี 35 ± 2 OC เป็นเวลา 16-18 ชม. ส�ำหรับ gentamicin และ 24-28 ชม.
ส�ำหรับ streptomycin

คูม่ ือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา