บทปฏิบัติการที� 8 อาณาจักรสัตว์ Animal Kingdom 93 ไฟลัมมอลลัสกา (Phylum Mollusca) มอลลัสกา (Mollusca, L.; molluscus = soft) เปนไฟลัมของสัตวพวกหอย หมึก ลักษณะเดนของ สัตวในไฟลัมนี้คือการมีลําตัวออนนิ่มเปนกอนอวัยวะภายในที่มีผนังลําตัวบางหุมเอาไว มอลลัสคมีสมมาตรแบบ ซีกซาย-ขวา มีชองวางในลําตัวที่แทจริง (eucoelom) ทางเดินอาหารเปนแบบสมบูรณ สวนใหญมีระบบ หมุนเวียนเลือดแบบเปด รางกายแบงเปน 2 สวน ดังนี้ 1. ลําตัวออนนิ่ม ประกอบดวยสวนหัว (head) เทา (foot) กอนอวัยวะภายใน (visceral mass) และแมนเทิล (mantle) 2. เปลือก (shell) มอลลัสคสวนใหญมีเปลือกแข็งหุมลําตัว จัดเปนโครงรางแข็งภายนอก (exoskeleton) ทําหนาที่ในการปองกันตัวและค้ําจุนรางกาย เปลือกมีสารพวกหินปูนเปนสวนประกอบ อาจมี 1 , 2 หรือหลาย เปลือก รูปรางของเปลือกแตกตางกันไปในแตละกลุม ตัวอยางของสัตวในไฟลัมมอลลัสกา ไดแก หอยฝาชีโบราณ ลิ่นทะเล หอยงาชาง หอยฝาเดียว ทาก ชนิดตางๆ หอยสองฝาชนิดตางๆ หอยงวงชาง และหมึกตางๆ หมึกจัดอยูในคลาส Cephalopoda แบงเปน 3 กลุมยอย โดยใชจํานวนหนวด ลักษณะของครีบ และโครงรางค้ําจุนรางกายเปนเกณฑในการจําแนก ไดแก กลุมหมึกกลวย เปนกลุมที่มีหนวด 10 เสน ครีบเปน รูปสามเหลี่ยมอยูสวนทายของลําตัว หรือครีบยาวตลอดดานขางตัวและเชื่อมกันตอนทาย โครงรางภายในเปน เพน (pen) กลุมหมึกกระดอง เปนกลุมที่มีหนวด 10 เสน ครีบยาวตลอดดานขางตัวแตไมเชื่อมตอกันตอนทาย ตัว โครงสรางภายในเปนคัตเทิลโบน (cuttle bone) กลุมหมึกยักษ เปนกลุมที่มีหนวด 8 เสน ไมมีครีบ และ ไมมีโครงรางภายใน ไฟลัมแอนนิลิดา (Phylum Annelida) แอนนิลิดา (Annelida, L.; annelus = little ring) เปนไฟลัมของหนอนที่มีลําตัวเปนปลอง (segmented worms) มีเนื้อเยื่อ 3 ชั้น มีชองวางลําตัวที่แทจริง (eucoelom) มีเดือย (setae) อยูที่ผิวตัว ชนิดที่มีมีรยางคขางตัว (parapodia) เดือยจะอยูบนรยางคนี้ มีไคลเทลลัมเปนบริเวณที่เกี่ยวของกับ การสืบพันธุ ซึ่งเห็นไดชัดในไสเดือนดิน ระบบหมุนเวียนเลือดเปนแบบปด มีหัวใจเทียม (pseudoheart) และ เสนเลือด ระบบประสาทประกอบดวย สมองและปมประสาท มีทั้งเพศรวมและแยกเพศ การดํารงชีวิตมีทั้ง ดํารงชีวิตอิสระและเปนปรสิต ตัวอยางสัตวในไฟลัมแอนนิลิดา ไดแก แมเพรียง หนอนฉัตร ไสเดือนดิน ไสเดือนน้ํา ปลิงน้ําจืด และทากดูดเลือด ไฟลัมอารโธรโพดา (Phylum Arthropoda) อารโธรโพดา (Arthropoda, Gr.; arthron = joint + pous, podos = foot) เปนกลุมสัตวที่ลําตัว แบงเปนปลอง แตละปลองมีรยางคเปนคู (1 หรือ 2 คู) โดยรยางคมีลักษณะเปนขอ (jointed appendages) มีเปลือกหุมตัวทางดานนอก (exoskeleton) การเจริญเติบโตจึงตองมีการลอกคราบ (molting) ซึ่งเปนการ ลอกเปลือกเกาทิ้งและสรางเปลือกใหมที่มีขนาดใหญกวาขึ้นแทน ระบบประสาทของอารโธรพอดเปนแบบปม ประสาท ซึ่งมีปลองละ 1 คู และเชื่อมโยงตอกันระหวางปลอง มีปมประสาทขนาดใหญทางดานหนาทําหนาที่ เปนสมอง ทางเดินอาหารสมบูรณ ระบบหมุนเวียนเลือดเปนแบบเปด อวัยวะที่ใชในการหายใจแตกตางกันไป ในแตละกลุม กลุมที่อาศัยบนบกหายใจโดยใชระบบทอลม (tracheal system) และปอด กลุมที่อาศัยในน้ํา หายใจโดยใชเหงือก สวนมากมีเพศแยก รางกายแบงเปน 3 สวน ไดแก หัว (head) อก (thorax) และทอง (abdomen) บางชนิดมีสวนหัวและสวนอกรวมกัน เรียกวา เซฟาโลธอรแลกซ (Cephalothorax) บางชนิด
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.สุคนธทิพย เศวตนลินทล และ อ.ดร.ศักดิ์บวร ตุมปสุวรรณ 94 สวนอกรวมกับสวนทอง เรียกวา ลําตัว (trunk) สัตวในไฟลัมอารโธรโพดามีความหลากชนิดมากที่สุดใน อาณาจักรสัตว โดยมีจํานวนมากถึง 900,000 ชนิด ตัวอยางสัตวในไฟลัมอารโธรโพดา ไดแก แมงดาทะเล แมงมุมทะเล แมงมุม แมงปอง กุง กั้ง ปู ไรน้ํา ตะขาบ กิ้งกือ ไฟลัมเอไคโนเดอรมาตา (Phylum Echinodermata) เอไคโนเดอรมาตา (Echinodermata, Gr.; echinos = sea urchin + derma = skin) เปนไฟลัมที่ สมาชิกอาศัยอยูในทะเลทั้งหมด ลักษณะเดนคือมีหนามปกคลุมทั่วตัว โครงรางภายในเปนแผนหินปูน (calcareous ossicle) เรียงตอกัน มีชองตัวที่แทจริง (eucoelom) สวนมากมีทางเดินอาหารสมบูรณ ตัวออน มีสมมาตรแบบซีกซาย-ขวา (bilateral symmetry) ตัวเต็มวัยมีสมมาตรแบบรัศมี (radial symmetry) มีระบบทอน้ํา (water vascular system) สําหรับหมุนเวียนน้ํา แตละกลุมมีรูปรางและขนาดแตกตางกัน สวนใหญมีรูปรางเปนแฉกรูปดาว เชน ดาวทะเล (sea star หรือ star fish) หรือทรงกลม บางชนิดเปน ทรงกระบอก ตัวอยางสัตวในไฟลัมเอไคโนเดอรมาตา ไดแก ดาวทะเล ดาวหมอนปกเข็ม ดาวเปราะ ดาวตะกรา เมนทะเล เมนหัวใจ อีแปะทะเล ปลิงทะเล พลับพลึง ดาวขนนก ไฟลัมเฮมิคอรดาตา (Phylum Hemichordata) เฮมิคอรดาตา (Hemichordata, Gr.; hemi = half + chorda = cord) เปนไฟลัมของสัตวที่มี ลักษณะคลายหนอน รางกายแบงเปน 3 สวน คือ โพรบอสซิส (proboscis) ปลอกคอ (collar) และลําตัว (trunk) สวนมากมีชองเหงือก (pharyngeal gill slits) ใชในการแลกเปลี่ยนกาซ มีทางเดินอาหารสมบูรณ ระบบหมุนเวียนเลือดเปนแบบเปด มีเพศแยก อาศัยอยูในทะเล อาจอาศัยอยูเดี่ยวๆ หรืออยูเปนโคโลนี ไฟลัมคอรดาตา (Phylum Chordata) คอรดาตา (Chordata, L.; chorda = cord) เปนไฟลัมของสัตวที่เจริญและมีวิวัฒนาการสูงสุดใน อาณาจักรสัตว ลักษณะของคอรเดตไดแก 1. มีโนโตคอรด (notochord) เปนแทงทางดานหลังของรางกาย อาจมีอยูเฉพาะในระยะตัว ออน หรือมีอยูตลอดชีวิต 2. มีชองเหงือกที่ผนังคอหอย (pharyngeal gill slits) ในชวงใดชวงหนึ่งของวงชีวิต 3. มีเสนประสาทดานหลัง (dorsal tubular nerve cord) เปนทอยาวตลอดลําตัวทางดานหลัง ของรางกาย โดยทางสวนหัวมีการเปลี่ยนแปลงเปนสมอง ทางสวนทายพัฒนาเปนไขสันหลัง (spinal cord) 4. มีหางอยูทางดานหลังของทวารหนัก (post-anal tail) ลักษณะสําคัญอื่นๆของคอรเดต เชน มีหัวใจอยูทางดานทอง มีระบบหมุนเวียนเลือดแบบปด ระบบ ทางเดินอาหารเปนแบบสมบูรณ มีโครงรางค้ําจุนรางกายอยูภายในตัว (endoskeleton)
บทปฏิบัติการที� 8 อาณาจักรสัตว์ Animal Kingdom 95 การจัดหมวดหมู ไฟลัมคอรดาตาแบงเปน 2 กลุม ไดแก 1. Group Acrania เปนกลุมที่ไมมีกะโหลกหุมสมอง (cranium) แบงเปน 2 ซับไฟลัม ไดแก Subphylum Urochordata ไดแก เพรียงหัวหอม Subphylum Cephalochordata ไดแก แอมฟออกซัส หรือ ตัวใบหอก 2. Group Craniata เปนกลุมที่มีกะโหลกหุมสมอง มีเพียงซับไฟลัมเดียว Subphylum Vertebrata Superclass Agnatha เปนสัตวที่ไมมีขากรรไกร Class Cyclostomata ไดแก hagfishes, lampreys Superclass Gnathostomata เปนสัตวที่มีขากรรไกร Class Chondrichthyes ไดแก ปลากระดูกออน เชน ฉลาม ปลากระเบน Class Osteichthyes ไดแก ปลากระดูกแข็ง เชน ปลาตะเพียน ปลานิล Class Amphibia ไดแก สัตวครึ่งบกครึ่งน้ํา เชน เขียดงู ซาลาแมนเดอร กบ คางคก Class Reptilia ไดแก สัตวเลื้อยคลาน เชน งู จิ้งจก เตา จระเข Class Aves ไดแก สัตวปก เชน นก เปด ไก Class Mammalia ไดแก สัตวเลี้ยงลูกดวยน้ํานม เชน คางคาว ปลาวาฬ หนู แมว ปลาโลมา หมา ชาง มา สิงโต ลิง คน วัตถุประสงค 1. เพื่อใหทราบลักษณะสําคัญของสัตวในไฟลัมตางๆ 2. สามารถเปรียบเทียบลักษณะของสัตวระหวางไฟลัมได 3. เพื่อใหทราบวิธีการจําแนกสัตวโดยใชรูปวิธาน Dichotomous key 4. เพื่อใหทราบวิธีการสรางรูปวิธาน Dichotomous key กิจกรรมที่ 8.1 การศึกษาสัตวไฟลัมตางๆ อุปกรณและสารเคมี 1. ตัวอยางดองและตัวอยางแหงของสัตวไฟลัมตางๆ 2. สไลดถาวรของสัตวไฟลัมตางๆ 3. แผนภาพของสัตวไฟลัมตางๆ 4. กลองจุลทรรศน 5. กลองสเตอริโอ วิธีปฏิบัติการ 1. ศึกษาลักษณะสัตวไฟลัมตางๆ จากตัวอยางดอง ตัวอยางแหง สไลดถาวรและแผนภาพ 2. บันทึกผลปฏิบัติการ
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.สุคนธทิพย เศวตนลินทล และ อ.ดร.ศักดิ์บวร ตุมปสุวรรณ 96 กิจกรรมที่ 8.2 การจําแนกสัตวโดยใชรูปวิธาน Dichotomous key กิจกรรมที่ 8.2.1 ใหนิสิตศึกษาลักษณะของสัตวกลุมตางๆ จากภาพ และจําแนกกลุมสัตวโดยใชรูป วิธาน Dichotomous key อุปกรณ 1. ภาพสัตวไฟลัมตางๆ 2. Dichotomous key ระดับไฟลัม วิธีปฏิบัติการ 1. ศึกษาลักษณะสัตวไฟลัมตางๆ จากภาพ และนํามาพิจารณาลักษณะตาม Key to phyla 2. บันทึกผลปฏิบัติการลงในตาราง A B C D E Key to Phyla 1. a. ลําตัวมีรูพรุน ……………………………………………………………………………………………. Porifera b. ลําตัวไมมีรูพรุน …………………………………………………………………….…………………………... 2 2. a. มีสมมาตรแบบรัศมี (Radial) ……………………………………............................................…. 3 b. มีสมมาตรแบบครึ่งซีก (Bilateral) ………………………………………………………………….…..… 5 3. a. มีรูปรางเปนแบบโพลิป (Polyp) หรือเมดูซา (Medusa) มีหนวด (tentacle) ………….... 4 b. ลําตัวเปนแฉก หรือ ทรงกระบอก มีโครงรางแข็งภายในรางกาย ใชเทาทอ (tube feet) ในการเคลื่อนที่ ………………………..………………. Echinodermata 4. a. มีรูปรางเปนแบบเมดูซาเทานั้น มีแผงหวี (comb plate) เรียง 8 แถว มีเซลลคอลโลบลาสท (colloblast) …………………………………………………… Ctenophora b. มีรูปรางเปนแบบโพลิปหรือเมดูซา หนวดมีเซลลเข็มพิษ (Cnidocyte) …………. Cnidaria
บทปฏิบัติการที� 8 อาณาจักรสัตว์ Animal Kingdom 97 5. a. ลําตัวแบงเปนปลอง ………………………………………………………..………………..……………….. 6 b. ลําตัวไมแบงเปนปลอง ……………………………………………………………………………………….. 7 6. a. ลําตัวออนนิ่ม ทรงกระบอก ………………………………………………….………………… Annelida b. มีโครงรางแข็ง (Exoskeleton) ปกคลุมรางกาย ลําตัวแบงเปนหลายสวน มีรยางคเปนขอ …………………………………………………………..……………………. Arthropoda 7. a. ลําตัวแบน ทางเดินอาหารมีชองเปด 1 ทาง ………………………...………… Platyhelminthes b. ลําตัวไมแบน ทางเดินอาหารมีชองเปด 2 ทาง คือ ปาก และ ทวารหนัก ………………….. 8 8. a. ลําตัวออนนิ่ม มีสวนเทาชัดเจน มีแผงฟนหรือแรดูลา (radula) บางชนิดมีเปลือก (shell) ……………………….………………………………….………… Mollusca b. มีโครงรางภายในรางกายเปนกระดูกออนหรือกระดูกแข็ง ………………………... Chordata กิจกรรมที่ 8.2.2 ใหนิสิตศึกษาลักษณะของสัตวตางๆ จากภาพ และนํามาสรางรูปวิธาน Dichotomous key อุปกรณ ภาพสัตวตางๆ วิธีปฏิบัติการ 1. พิจารณาลักษณะสัตวตางๆ จากภาพ และนํามาสรางรูปวิธาน Dichotomous key 2. บันทึกผลปฏิบัติการ
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.สุคนธทิพย เศวตนลินทล และ อ.ดร.ศักดิ์บวร ตุมปสุวรรณ 98 บรรณานุกรม คณาจารย. 2552. คูมือปฏิบัติการสัตววิทยา. ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยมหาสารคาม, มหาสารคาม. บพิธ จารุพันธุ และนันทพร จารพันธุ. 2540. สัตววิทยา : ปฏิบัติการ. คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัย เกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. บพิธ จารุพันธุ และนันทพร จารพันธุ. 2544. สัตววิทยา. คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. Hickman, C.P., Robert, L.S. and Larson, A. 2001. Integrated principles of Zoology. 11th ed. McGrawHill company, Inc. New York, U.S.A. Pechenik, J.A. 1996. Biology of the Invertebrates. 3rd ed. Wm. C. Brown Pulishers. Dubuque, IA., U.S.A. Ruppert, E.E., Fox, R.S. and Barnes, R.D. 2004. Invertebrate Zoology. 7th ed. Brooks/Cole- Thomson Learning. Belmont, CA, U.S.A. Tamplin, J.W., Stickle, W.B. and Woodring, J.P. 1997. Introductory Zoology Laboratory Guide. 2nd ed. Morton Publishing Company. Colorado, U.S.A. Wallace, L.T. and Taylor, W.K. 1997. Invertebrate Zoology: A Laboratory Manual. Prentice Hall, Inc. New Jersey, U.S.A.
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 99 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม 9 ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ (DNA Extraction and Genetic Engineering) บทนำา วัตถุประสงค์ กิจกรรมที่ 9.1 การสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอ จากเซลล์แบคทีเร�ยด้วยว�ธ� Alkaline Lysis กิจกรรมที่ 9.2 การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดดีเอ็นเอ ของแบคทีเร�ย คำาถามท้ายบท บรรณานุกรม บทปฏิบัติการที่
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 100
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 101 บทปฏิบัติการที่ 11 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม (DNA Extraction and Genetic Engineering) ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ บทนํา สิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีการถายทอดลักษณะพันธุกรรมซึ่งลักษณะการถายทอดทางพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิต ถูกควบคุมโดยสิ่งที่เรียกวา ยีน (gene) ซึ่งเปนสิ่งที่มีความทาทายใหนักวิทยาศาสตรพยายามที่จะศึกษาถึง โครงสราง องคประกอบ หนาที่ รวมถึงกระบวนการตาง ๆ ที่เกี่ยวของกับยีน โดยเปนที่ทราบกันดีในปจจุบันวา องคประกอบทางเคมีของยีน คือ ดีเอ็นเอที่เปนสารประกอบพวกกรดนิวคลีอิก ดังนั้นในกระบวนการศึกษา บทบาทตาง ๆ ของยีนจําเปนอยางยิ่งที่ตองทําการแยกกรดนิวคลีอิกออกมาจากเซลลของสิ่งมีชีวิตที่สนใจ สารพันธุกรรม (genetic material) เปนสารประกอบพวกกรดนิวคลิอิก (nucleic acid) ที่ ประกอบขึ้นจากโพลิเมอรของนิวคลีโอไทด (ภาพที่ 9.1) โดยแตละนิวคลีโอไทดประกอบดวย 1. เบสไนโตรเจน (nitrogenous base) ซึ่งแบงไดตามลักษณะโครงสรางของโมเลกุลที่แตกตาง กัน 2 ชนิด คือ ไพริมิดีน (pyrimidine) ไดแก ไซโตซีน (cytosine; C) ไทมีน (thymine; T) และยูราซิล (uracil; U) สวนเพียวรีน (purine) ไดแก อะดีนีน (adenine; A) และกัวนีน (guanine; G) (ภาพที่ 9.2) 2. น้ําตาลเพนโทส ซึ่งแบงได 2 ชนิดตามน้ําตาลเพนโทสที่เปนองคประกอบในโมเลกุล คือ น้ําตาลดีออกซีไรโบส (D-2-deoxyribose) และน้ําตาลไรโบส (D-ribose) (ภาพที่ 9.3) 3. หมูฟอสเฟต กรดนิวคลิอิกสามารถแบงออกเปน 2 ชนิด ตามองคประกอบโครงสรางนิวคลีโอไทด ซึ่ง ตางกันที่เบสไนโตรเจน และน้ําตาลเพนโทส คือ ดีเอ็นเอ (deoxyribonucleic acid; DNA) มีเบสไนโตรเจนที่ ประกอบดวย A, C, G, T และน้ําตาลเพนโทสเปนน้ําตาลดีออกซีไรโบส (D-2-deoxyribose) และอารเอ็นเอ (ribonucleic acid; RNA) มีเบสไนโตรเจนที่ประกอบดวย A, C, G, U และน้ําตาลเพนโทสเปนน้ําตาลไรโบส (D-ribose) โดยดีเอ็นเอเปนสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด หรือกลาวไดวาดีเอ็นเอเปนแบบพิมพเขียว (blue print) ของสิ่งมีชีวิตนั่นเอง มีหนาที่กําหนดการสังเคราะหโปรตีนในสิ่งมีชีวิตนั้น ๆ ภาพที่ 9.1 โครงสรางของนิวคลีโอไทด (ที่มา: Russell, 1996) การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ (DNA Extraction and Genetic Engineering)
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 102 ภาพที่ 9.2 โครงสรางของเบสไนโตรเจน (ที่มา: Russell, 1996) ภาพที่ 9.3 โครงสรางของน้ําตาลดีออกซีไรโบสและน้ําตาลไรโบส (ที่มา: Russell, 1996) ภาพที่ 9.4 โครงสรางของดีเอ็นเอที่มีลักษณะเปนเกลียวคูสายยาวในลักษณะสวนทิศทางกัน (ที่มา: ดัดแปลงจาก Campbell et al., 2000) ในสิ่งมีชีวิตชั้นสูงดีเอ็นเอ จะมีโครงสรางตามธรรมชาติเปนเกลียวคูสายยาว (double helix) พันอยู กับโปรตีนฮีสโตน (ภาพที่ 9.5) ในลักษณะเหมือนลูกปดบนสรอยคอ (beads on a string) เปนลักษณะของ โครโมโซมที่นิวเคลียสของเซลลมีเยื่อหุม (nuclear membrane) ซึ่งพบไดที่นิวเคลียสและไมโทคอนเดรีย สําหรับในพืชยังสามารถพบดีเอ็นเอไดที่คลอโรพลาสตอีกดวย โดยทั่วไปดีเอ็นเอในยูคาริโอตมีความยาว มากกวาแบคทีเรียถึง 1,000 เทา เชน ในมนุษยมีดีเอ็นเอในนิวเคลียส 23 โมเลกุลตอ 1 ชุด มีความยาวตั้งแต 1.6 - 8.4 เซนติเมตรตอโมเลกุล ซึ่งเมื่อรวมความยาวทั้งหมดไดประมาณ 1 เมตร ขณะที่ในแบคทีเรียมีความ
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 103 ยาวของดีเอ็นเอเพียง 1.1 มิลลิเมตร ดังนั้นในสิ่งมีชีวิตพวกยูคาริโอตจึงตองมีการจัดระบบในการบรรจุดีเอ็นเอ อยางมีระบบและเปนระเบียบใหมากที่สุด จากการที่สิ่งมีชีวิตพวกยูคาริโอตและโปรคาริโอตมีความยาวของดีเอ็นเอแตกตางกันมากจึงทําใหใน ขั้นตอนของการแยกสกัดดีเอ็นเอจากยูคาริโอตซึ่งมีความยาวมาก ๆ จําเปนตองทําดวยความระมัดระวังเพื่อ ปองกันการฉีกขาดและการเสียสภาพธรรมชาติของดีเอ็นเอ เพราะการที่เกิดการฉีกขาดหรือเสียสภาพยอมมีผล โดยตรงตอโครงสรางและหนาที่ของดีเอ็นเอได ภาพที่ 9.5 ลักษณะของดีเอ็นเอเกลียวคูที่เขารวมกับโปรตีนฮีสโตนแลวมีการมวนพับอยางมีระเบียบทําใหเกิด เปนโครงสรางที่เรียกวาโครโมโซม (ที่มา: Russell, 2000) สมบัติของกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกละลายน้ําไดดีในสภาวะที่เปนกลาง (pH 7.0) หรือกรดออน โมเลกุลโดยรวมมีประจุเปนลบจากหมูฟอสเฟตที่เปนองคประกอบของกรดนิวคลีอิก ดังนั้นดีเอ็นเอที่ละลายอยู บัพเฟอรที่มี pH 7.0 จึงมีความหนืดสูงเนื่องจากมีการผลักกันของประจุลบ ทําใหโมเลกุลของกรดนิวคลีอิก เหยียดตัวออก จากคุณสมบัติดังกลาวจึงทําใหดีเอ็นเอมีความสามารถในการจับกับโปรตีนที่มีประจุบวกได เชน โปรตีนฮีสโตน นอกจากนี้ในสภาวะที่มีอุณหภูมิสูงหรือเปนดางมากทําใหพันธะไฮโดรเจนที่ยึดระหวางดีเอ็นเอ ทั้ง 2 สายถูกทําลายทําใหไดเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยว 2 สาย หรือเรียกอีกอยางหนึ่งวาเกิดการเสียสภาพของดีเอ็นเอ (DNA denaturation) อยางไรก็ตามสามารถทําใหดีเอ็นเอเกิดการรวมตัวกันเปนกอนเพื่อใหเกิดการตกตะกอน ได เชน การเติมสารพวกแอลกอฮอล
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 104 การตรวจสอบปริมาณและคุณภาพของดีเอ็นเอ การที่สิ่งมีชีวิตพวกยูคาริโอตและโปรคาริโอตมี ความยาวของดีเอ็นเอแตกตางกันมากจึงทําใหในขั้นตอนของการแยกสกัดดีเอ็นเอจากยูคาริโอตซึ่งมีความยาว มากๆ จําเปนตองทําดวยความระมัดระวังเพื่อปองกันการฉีกขาดและการเสียสภาพธรรมชาติของดีเอ็นเอ เพราะการที่เกิดการฉีกขาดหรือเสียสภาพยอมมีผลโดยตรงตอโครงสรางและหนาที่ของดีเอ็นเอไดดีเอ็นเอที่ สกัดไดจะมีลักษณะเปนสารละลายใส ซึ่งสามารถบงชี้วาสารละลายดังกลาวเปนดีเอ็นเอไดโดยอาศัยคุณสมบัติ การดูดกลืนคลื่นแสงอุลตราไวโอเลตของเบสที่เปนองคประกอบของดีเอ็นเอ ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร โดยการดูดกลืนคลื่นแสง 1 หนวย (OD) ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร จะมีปริมาณของดีเอ็นเอประมาณ 50 ไมโครกรัม และสามารถตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอที่สกัดได โดยการทําอิเล็กโทรโฟริซีสแบบอะกาโรส (agarose gel electrophoresis) โดยอาศัยโครงสรางของสายดีเอ็นเอในธรรมชาติที่มักพบในลักษณะ 2 สาย คูกัน อยูในสภาพเกลียวคูที่เปนแบบ 2 สายสวนทางกัน (antiparallel) มีคูเบสจับกันเปนขั้นบันได ทําใหสาร เรืองแสง เชน เอทิเดียมโบรไมด (EtBr) แทรกเขาไปในเกลียวคูของดีเอ็นเอ เมื่อสองดวยแสงอุลตราไวโอเลตจะ เห็นเรืองแสงไดดีขึ้น โดยถาดีเอ็นเอที่สกัดไดมีคุณภาพดีจะเห็นแถบเรืองแสงเดียวแตถาคุณภาพของดีเอ็นเอ ไมดี มีการแตกหักของสายดีเอ็นเอเปนสายสั้น ๆ (DNA fragment) จะเห็นแถบเรืองแสงคลายดาวหางบนแผน อะกาโรส (ภาพที่ 9.6) นอกจากนี้ยังสามารถตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอไดโดยการหาอัตราสวนของคาการดูดกลืนแสง ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร ตอความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร หากวาดีเอ็นเอที่สกัดไดมีคุณภาพที่ดี มี ความบริสุทธิ์มาก จะมีคาอัตราสวนดังกลาวเทากับ 1.7-1.8 แตถาดีเอ็นเอที่สกัดไดมีสวนของอารเอ็นเอเจือปน อยูจะมีคามากกวา 1.8 เนื่องจากอารเอ็นเอจัดเปนกรดนิวคลิอิกชนิดหนึ่ง ดังนั้น จึงมีเบสที่สามารถดูดกลืนแสง อัลตราไวโอเลตไดเชนกัน จึงทําใหคาการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลตมากขึ้น และถาดีเอ็นเอที่สกัดไดมีโปรตีน ปนเปอนอยูจะมีคาอัตราสวนนอยกวา 1.7 เนื่องจากโปรตีนมีหมูที่สามารถดูดกลืนคลื่นแสงไดที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร ภาพที่ 9.6 การตรวจสอบปริมาณและคุณภาพของดีเอ็นเอดวยวิธีเจลอิเล็กโทรโฟริซีส (ที่มา: Campbell and Reece, 2002)
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 105 ปจจัยที่มีผลกระทบตอคุณภาพของดีเอ็นเอ การแยกสกัดดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตสิ่งที่ตองคํานึงถึง เรื่องของความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่เตรียมได โดยดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีตองปราศจากการปนเปอนของโมเลกุล อื่นที่ไมตองการ เชน โปรตีน ไขมัน และโพลีแซคคาไรด เปนตน ซึ่งวิธีในการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของดีเอ็น เอสามารถพิจารณาไดจากการเปรียบเทียบอัตราสวนของการดูดกลืนแสงของกรดนิวคลีอิกกับโปรตีนที่ความ ยาวคลื่น 260/280 นาโนเมตร โดยกรดนิวคลีอิกที่มีความบริสุทธิ์อยูในเกณฑดีตองมีอัตราสวนดังกลาวอยาง นอยเทากับ 1.8 และอีกประการหนึ่งที่ตองคํานึงถึง คือ ขนาดของดีเอ็นเอ ซึ่งในการเตรียมดีเอ็นเอจําเปนตอง ทําดวยความนิ่มนวล เบามือ เพื่อปองกันการฉีกขาดของโมเลกุลดีเอ็นเอโดยเฉพาะดีเอ็นเอที่มีลักษณะเปน เกลียวคูสายยาว ขั้นตอนของการแยกสกัดดีเอ็นเอ ในการสกัดดีเอ็นเอมักประกอบดวยขั้นตอนดังนี้ คือ 1. การทําใหเซลลแตก สามารถทําไดโดยวิธีกล เชน ดวยการบดเนื้อเยื่อรวมกับไนโตรเจนเหลว ใหเปนผงละเอียด หรือการทําใหเซลลแตกดวยสารเคมีหรือเอนไซม ตัวอยางเชน ยอยผนังเซลลดวยเอนไซม เชน lysozyme, cellulose, chitinase 2. ขั้นตอนของการกําจัดเศษเซลลและการกําจัดโปรตีนที่ไมตองการทิ้ง สามารถทําไดโดยการทํา ใหโปรตีนเสียสภาพธรรมชาติโดยการเติมสารที่เปน ionic detergent เชน sodium dodecyl sulfate (SDS) เพื่อเปนการลดแรงดึงดูดระหวางโปรตีนและกรดนิวคลีอิก หรือการกําจัดโปรตีนโดยการเติมสารที่เปนดางจัด ไดแก สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 3. การแยกสกัดโปรตีนออกจากกรดนิวคลีอิกดวยตัวทําละลายอินทรีย โดยสารที่นิยมใช ไดแก ฟนอล และคลอโรฟอรม ซึ่งสารทั้งสองชนิดจะทําใหโปรตีนเสียสภาพธรรมชาติ และแยกโปรตีนออกไปคนละ สวนของสารละลาย โดยกรดนิวคลีอิกจะละลายอยูในชั้นของน้ําสวนบน ขณะที่โปรตีนและสิ่งปนเปอนอื่นๆ จะ อยูระหวางชั้นของน้ํา และฟนอล/คลอโรฟอรม 4. การตกตะกอนกรดนิวคลีอิกดวยแอลกอฮอล โดยปกติกรดนิวคลีอิกสามารถละลายไดดีใน บัพเฟอรที่มี pH เปนกลาง แตจะไมละลายในสารละลายที่เปนกรดหรือแอลกอฮอล ดังนั้นเมื่อมีการเติม แอลกอฮอลลงในสารละลายกรดนิวคลีอิกจึงทําใหกรดนิวคลีอิกเกิดการรวมตัวเปนกลุมกอนขนาดใหญจน สามารถมองเห็นไดดวยตาเปลา 5. การเก็บรักษากรดนิวคลีอิกหรือดีเอ็นเอที่แยกสกัดได ควรเก็บอยูในน้ําบริสุทธิ์หรือบัพเฟอร เชน บัพเฟอร TE ที่สะอาดปราศจากสิ่งปนเปอนที่อุณหภูมิ -20 หรือ -80 องศาเซลเซียส การสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจากเซลลแบคทีเรียดวยวิธี Alkaline Lysis การสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอ จากเซลลแบคทีเรีย โดยวิธีการทําใหเซลลแบคทีเรียแตกสลายดวยสารละลายที่มีสวนประกอบของ sodium hydroxide (NaOH) และ sodium dodecylsulfate (SDS) โดยที่ SDS จะทําใหเกิดการเสียสภาพตาม ธรรมชาติของโปรตีนในเซลลแบคทีเรีย สวน NaOH จะทําใหเกิดการเสียสภาพตามธรรมชาติของโครโมโซม และพลาสมิดดีเอ็นเอ ซึ่งเมื่อทําการเติมสารละลาย potassium acetate ที่มีสภาพเปนกรด เพื่อปรับสภาพ สวนผสมจากสภาวะที่เปนดางใหกลับคืนสภาพเปนกลาง (neutralisation) พลาสมิดดีเอ็นเอที่ถูกทําใหเสีย สภาพไปกอนหนานี้ จะกลับคืนสูสภาพเดิมอยางรวดเร็ว ในขณะที่โปรตีนและโครโมโซมที่เสียสภาพธรรมชาติ ไมสามารถกลับคืนสูสภาพเดิมได และจะถูกจับไวดวยโครงสรางที่มีความซับซอน ที่เกิดจากการรวมตัวกัน ระหวาง SDS และ potassium ตกตะกอนออกมาใหเห็นเปนกอนสีขาว และภายหลังที่ไดทําการแยกตะกอน ขาวออกไปโดยการปนเหวี่ยงหรือการกรองพลาสมิดจะถูกแยกออกมาจากสวนผสม โดยการตกตะกอนดวย แอลกอฮอลบริสุทธิ์ (ethanol precipitation) (จุฑาพร แสงประจักษ, 2554)
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 106 พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering) ปจจุบันเทคโนโลยีทางดานพันธุศาสตรระดับโมเลกุลและพันธุวิศวกรรมศาสตรมีความสําคัญตอการ ดําเนินชีวิตของมนุษย เนื่องจากถูกนํามาใชประโยชนทางดานตาง ๆ เชน การแพทย อุตสาหกรรม และ เกษตรกรรม นอกจากนี้การศึกษาวิจัยในระดับหองปฏิบัติการก็มีอยางตอเนื่องและมีการพัฒนาเทคนิคใหม ๆ อยูเสมอ บทปฏิบัติการนี้มีเนื้อหาเกี่ยวกับการแยกสกัดสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตและพันธุวิศวกรรมเบื้องตน เพื่อสรางสิ่งมีชีวิตดัดแปรพันธุกรรม (GMOs) เชน การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดดีเอ็นเอของแบคทีเรียเริ่มจากการตัดยีนหรือดีเอ็นเอที่ตองการศึกษา ดวยเอนไซมตัดจําเพาะแลวนํามาเชื่อมตอกับดีเอ็นเอพาหะ (DNA vector) เชน พลาสมิด (plasmid) จนได เปนดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA) แลวทําการสงถายดีเอ็นเอสายผสมที่ไดเขาสูเซลลเจาบาน (host cell) เชน แบคทีเรีย เมื่อเซลลเจาบานมีการเพิ่มจํานวนยีนหรือดีเอ็นเอที่ตองการศึกษานี้จะเพิ่มจํานวนตามไป ดวย เซลลเจาบานที่มีดีเอ็นเอสายผสมเหมือน ๆ กันเรียกวา โคลน (clone) (สุรินทร ปยะโชคณากุล, 2548) ดังภาพที่ 9.7 ภาพที่ 9.7 การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดดีเอ็นเอของแบคทีเรีย (ที่มา: Lodish et al., 2015) ในปจจุบันมีการสรางพลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีนตานยาปฏิชีวนะ เชน แอมพิซิลลิน (ampicillin resistance gene, ampr ), กานามัยซิน (kanamycin, kanr ) และเตตราซัยคลิน (tetracyclin, tetr ) เพื่อใช เปนยีนในการคัดเลือก (selectable gene) เซลลแบคทีเรียที่ไดรับพลาสมิดซึ่งจะเจริญไดในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ ใสยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน อยางไรก็ตามเซลลแบคทีเรียที่ไดรับพลาสมิดทุกเซลลจะเจริญไดแมวาพลาสมิดที่ อยูในเซลลนั้นจะไมมีชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการแทรกอยูก็ตาม จึงไมสามารถบอกไดวาโคลนใดมีชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนที่ ตองการ ดังนั้นในการสรางพลาสมิดจึงใสยีน lacZ ที่ควบคุมการสรางเอนไซม β-galactosidase เพื่อใชเปน
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 107 ยีนรายงานผล (reporter gene) วาพลาสมิดในเซลลแบคทีเรียนั้นมีชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการแทรกอยูหรือไม ซึ่ง เซลลเจาบานที่ไดรับดีเอ็นเอสายผสมจะมีลักษณะที่แตกตางไปจากเดิม ในยีน lacZ มีตําแหนงตัดจําเพาะของ เอนไซมตัดจําเพาะชนิดตาง ๆ ที่สามารถใสชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการแทรกเขาไป (ภาพที่ 9.8 และ 9.9) นอกจากนั้น การแทรกชิ้นดีเอ็นเอเขาไปในพลาสมิดในบริเวณยีน lacZ จะทําใหยีน lacZ ไมทํางานโดยไมสามารถสราง เอนไซม β-galactosidase ได เมื่อนําพลาสมิดใสเขาไปในเซลลเจาบานแลวเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใสยา ปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน และสาร IPTG ซึ่งเปนสารเหนี่ยวนําการสราง β-galactosidase พรอมกับใสสาร X–gal ซึ่งเปนสารตั้งตนของเอนไซมนี้ เซลลที่ไดรับพลาสมิดเทานั้นที่เจริญไดและเพิ่มจํานวนขึ้นจนมองเห็นเปนโคโลนี และสีของโคโลนีแบคทีเรียจะบอกไดวาแบคทีเรียโคลนนั้นสรางเอนไซม β-galactosidase ไดหรือไม และเปน ตัวรายงานผลวาแบคทีเรียโคลนนั้นไดรับดีเอ็นเอสายผสมหรือไม (สมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย, 2548) ดังภาพที่ 9.10 ภาพที่ 9.8 พลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีนเครื่องหมายในการคัดเลือกและยีนรายงานผล (ที่มา: สุนัดดา โยมญาติ, 2558) ภาพที่ 9.9 ขั้นตอนการสรางดีเอ็นเอสายผสม (ที่มา: ดัดแปลงจาก สุนัดดา โยมญาติ, 2558) ผสมพลาสมิดดีเอ็นเอและสาย ดีเอ็นเอที่สนใจที่ตัดดวย เอนไซมตัดจําเพาะแลว เชื่อมตอชิ้นดีเอ็นเอ กับพลาสมิดดวย เอนไซมDNA ligase ไดดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA)
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 108 ภาพที่ 9.10 ลักษณะของแบคทีเรียที่ไดรับและไมไดรับดีเอ็นเอสายผสม (ที่มา: ดัดแปลงจาก สุนัดดา โยมญาติ, 2558) พลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีนที่สนใจ แทรกอยูบริเวณยีน lacZ ถูกสงถาย สูเซลลแบคทีเรีย พลาสมิดดีเอ็นเอที่ไมมียีนที่สนใจ แทรกอยูบริเวณยีน lacZ ถูกสงถาย สูเซลลแบคทีเรีย ยีน lacZ ทํางานบกพรองทําให แบคทีเรียไมสามารถสรางเอนไซม β-galactosidase ได ยีน lacZ ทํางานได ทําใหแบคทีเรีย สามารถสรางเอนไซม β-galactosidase ได ไมมีเอนไซม β-galactosidase ยอย X-gal ทําใหมองเห็ยโคโลนีของแบคทีเรีย เปนสีขาว (recombinant colony) มีเอนไซม β-galactosidase ยอย X-gal ได สารสีฟา ทําใหมองเห็นโคโลนีของแบคทีเรีย เปนสีฟา (non-recombinant colony)
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 109 วัตถุประสงค 1. เพื่อใหนิสิตเขาใจถึงหลักการและวิธีการในการแยกสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจากเซลลของสิ่งมีชีวิต ดวยวิธี alkaline lysis ไดอยางถูกตองตามหลักการของการสกัดกรดนิวคลีอิก 2. เพื่อใหนิสิตเขาใจถึงหลักการและวิธีการในการการโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดดีเอ็นเอของ แบคทีเรีย กิจกรรมที่ 9.1 การสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจากเซลลแบคทีเรียดวยวิธี Alkaline Lysis วัสดุอุปกรณและสารเคมี 1. เซลลแบคทีเรียที่เลี้ยงในอาหารสังเคราะห Nutrient Broth เปนเวลา 12 ชั่วโมง 2. Solution I : 50 mMTris-EDTA pH 8.0 3. Solution II : NaOH/SDS lysis solution (0.2 NNaOH, 1% (w/v) SDS) 4. Solution III : 3M potassium acetate solution (pH 4.8) 5. 95% แอลกอฮอล 6. น้ํากลั่น 7. หลอดทดลองขนาดกลาง 8. ปเปตขนาด 1 มิลลิลิตร 9. ปเปตขนาด 5 มิลลิลิตร 10. จุกยางดูดสาร 11. กระดาษทิชชู วิธีการทดลอง 1. เตรียมเซลลแบคทีเรียโดยทําการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเปนเวลา 12 ชั่วโมง 2. นําหลอดทดลอง 3 หลอดใสเซลลแบคทีเรียประมาณ 1 มิลลิกรัม แลวเขียนหมายเลข 1 ถึง 3 3. เติม solution I ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใสหลอดทดลองหมายเลข 1 ถึง 3 โดยทําการเขยาหรือ ใหเซลลผสมเปนเนื้อเดียวกับสารละลาย 4. เติม solution II ปริมาตร 1 มิลลิลิตรใสหลอดทดลองหมายเลข 1 และ 3 แลวทําการเขยา หรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ 5. เติมน้ํากลั่นลงในหลอดหมายเลข 2 แลวทําการเขยาหรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ 6. เติม solution III ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใสหลอดทดลองหมายเลข 1 และ 2 แลวทําการเขยา หรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ ในขั้นตอนนี้จะเกิดตะกอนสีขาว 7. เติมแอลกอฮอล 95 เปอรเซ็นต ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลองหมายเลข 1 ถึง 3 แลวทําการผสมใหเขากันดวยการพลิกหลอดไปมาเบา ๆ ประมาณ 10 ครั้ง (ระวังอยาใหเกิดฟอง) แลวตั้งทิ้งไว ประมาณ 5 นาที สังเกตโมเลกุลของดีเอ็นเอที่เกิดในแตละหลอดแลวบันทึกผลการทดลอง
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 110 บันทึกผลการทดลอง หลอดที่ ลักษณะของโมเลกุลดีเอ็นเอที่พบ 1 2 3 กิจกรรมที่ 9.2 การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดดีเอ็นเอของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ 1. กระดาษสีฟาขนาดกวาง 2.5 cm ยาว 29 cm จํานวน 20 แผน 2. กระดาษสีเขียว กวาง 2.5 cm ยาว 20 cm จํานวน 20 แผน 3. กระดาษสีขาว สีฟา และสีแดง ขนาดกวาง 8 cm ยาว 8 cm สีละ 10 แผน 4. ถุงผาหรือถุงกระดาษทึบ 5 ถุง 5. ปากกา 6. เทปใส 7. กรรไกร 8. ถาด วิธีการทดลอง 1. นิสิตเขียนลําดับเบสของยีนที่ตานทานยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน (ampr ) ลงแถบบนกระดาษสี ฟาดังภาพสําหรับใชเปนพลาสมิดดีเอ็นเอหรือ download ไดจากhttp://biology.ipst.ac.th/?p=2828
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 111 2. เขียนลําดับเบสของยีนที่สนใจลงบนแถบกระดาษสีเขียวดังภาพ สําหรับใชเปนสายดีเอ็นเอที่ มีนที่สนใจ หรือ download ไดจาก http://biology.ipst.ac.th/?p=2828 3. นํากระดาษสีฟาที่เปนพลาสมิดดีเอ็นเอแตละชิ้นมวนติดกันเปนวงกลมดวยเทปใส 4. ใชปากกาวาดกรอบลอมรอบลําดับเบสที่เปนตําแหนงตัดจําเพาะของเอนไซม BamHI 5. จากนั้นใชกรรไกรตัดกระดาษสีฟาที่จุดตัดจําเพาะ 6. ใชกรรไกรตัดกระดาษสีเขียวตรงตําแหนงที่ตรงกับการตัดของเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI เชนเดียวกัน 7. จากนั้นตอแถบกระดาษใหเปนวงดังนี้ 7.1) ตอพลาสมิดดีเอ็นเอและชิ้นดีเอ็นเอที่สนใจเขาดวยกัน
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 112 7.2) ตอปลายชิ้นพลาสมิดดีเอ็นเอบริเวณที่ถูกตัดเขาดวยกัน 7.3) ตอปลายชิ้นดีเอ็นเอที่สนใจบริเวณที่ถูกตัดเขาดวยกัน หลังจากตอแถบกระดาษแลวจะไดสายดีเอ็นเอเปนวง 3 วง และนํากระดาษทั้ง 3 วง ใสลงในถุงทึบ 8. จากนั้นเตรียมถาดซึ่งใชแทนเซลลแบคทีเรียที่เปนเซลลเจาบานกลุมละ 4 ถาด วางไวตรง กลางโตะ ใหนิสิตสุมหยิบชิ้นดีเอ็นเอรูปวงแหวนจากถุงทึบของตนเองขึ้นมา 1 วง แลว ใสลงในถาด 1 ถาด ให สมาชิกในกลุมรวมกันพิจารณาเลือกถาดที่ไดรับวงแหวนดีเอ็นเอที่มีลักษณะแตกตางกันซึ่งจะมี 3 ถาดและ 1 ถาดที่ไมไดรับวงกระดาษใด ๆ
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 113 9. ใหสมาชิกในกลุมรวมกันพิจารณาวาวงแหวนดีเอ็นเอที่มีลักษณะตาง ๆ ในถาดนั้น ทําให ลักษณะฟโนไทปของโคโลนีแบคทีเรียเปนแบบใด แลวใสกระดาษสี่เหลี่ยมสีขาว สีฟา หรือสีแดง แผนใดแผน หนึ่งซึ่งแทนลักษณะสีของโคโลนีแบคทีเรียลงในแตละถาดดังนี้ - กรณีที่โคโลนีของแบคทีเรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อเปนสีขาวใหใสกระดาษสีขาว - กรณีที่โคโลนีของแบคทีเรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อเปนสีฟาใหใสกระดาษสีฟา - กรณีที่โคโลนีของแบคทีเรียไมเจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อใหใสสีแดง 10. สรุปและอภิปรายผลการทํากิจกรรมเกี่ยวกับลักษณะฟโนไทปของโคโลนีแบคทีเรียแตละ แบบวาเจริญเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใสยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน X-gal และ IPTG ไดหรือไม และถาเจริญ ไดจะเกิดเปนโคโลนีสีอะไรเพราะเหตุใด สรุปและวิจารณผลการทดลอง ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………...............................................................................................................................................
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 114 คําถามทายบท 1. สารละลาย (solution II) ทําหนาที่อะไรในการสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอ .............................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................. 2. เหตุใดในขั้นตอนของการตกตะกอนดีเอ็นเอจึงตองมีการเติมแอลกอฮอล .............................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................. 3. จงอธิบายคุณสมบัติของ DNA ที่สกัดไดหากพบวาคาอัตราสวนของการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร (nm) ตอความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร เปนดังนี้ อัตราสวนคาการดูดกลืนแสง (260 nm / 280 nm) คุณภาพของ DNA ที่สกัดได อัตราสวน = 1.50 อัตราสวน = 1.75 อัตราสวน = 2.00 4. ลักษณะโคโลนีแบคทีเรียที่มีพลาสมิดดีเอ็นเอที่ตอกับยีนที่สนใจเหตุใดจึงปรากฏเปนสีขาว……………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. .……………………………….………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………..………………………………………………………………………………………………………………………… 5. ลักษณะโคโลนีแบคทีเรียที่มีเฉพาะพลาสมิดดีเอ็นเอเหตุใดจึงปรากฏเปนสีฟา………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….....… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. ...................................…………………………………………………………………………………………………………………………… 6. แบคทีเรียที่มีเฉพาะชิ้นสวนดีเอ็นเอที่สนใจเหตุใดจึงไมสามารถเจริญเติบโตได..……………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..…………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7. จากกิจกรรมเรื่องการโคลนยีนนิสิตอธิบายความเกี่ยวของกับการสรางสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (Genetically Modified Organisms, GMOs) และยกตัวอยางผลิตภัณฑ GMOs……………………………………….. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. .……………………………….………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………………
บทปฏิบัติการที� 9 การแยกสกัดดีเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม DNA Extraction and Genetic Engineering 115 บรรณานุกรม จุฑาพร แสงประจักษ. 2554. เอกสารประกอบการสอนวิชาพันธุศาสตรโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยมหาสารคาม. สมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย. 2548. สาระนารูอณูพันธุศาสตร. กรุงเทพมหานคร: เท็กซแอนดเจอรนัล พับลิเคชัน จํากัด. สุนัดดา โยมญาติ. 2558. สื่อการสอนเรื่องพันธุศาสตรระดับโมเลกุลและพันธุวิศวกรรมศาสตรการโคลนยีน โดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย. วารสารสถาบันสงเสริมการสอนวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี. 44 (197): 3-7. สุรินทร ปยะโชคณากุล. 2548. พันธุวิศวกรรมเบื้องตน. พิมพครั้งที่ 3. กรุงเทพมหานคร : สํานักพิมพ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. Campbell NA and Reece JB. 2002. Biology 6th ed. San Francisco, Addison Wesley Longman, Inc. Campbell NA, Mitchell LG and Reece JB. 2000. Biology : concept & connections. San Francisco, Addison Wesley Longman, Inc. Russell PJ. 1996. Genetics 4thed. New York, HarperCollins College Publishers. Russell PJ. 2000. Fundamental of Genetics 2nded. San Francisco, Addison Wesley Longman. Inc. http://biology.ipst.ac.th/?p=2828
ปฏิบัติการชีววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มมส. ผศ.ดร.อภิเดช แสงดี และ ผศ.ดร.จุฑาพร แสงประจักษ์ 116